熒光二氯熒光素1

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1、熒光光譜分析法實(shí)驗(yàn)一、熒光分光光度計(jì)用于定性測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)原理：不同的熒光物質(zhì)吸收的激發(fā)光和發(fā)射的熒光波長(zhǎng)是不同的，同一熒光物質(zhì)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度與其濃度之間呈正比。因此可利用激發(fā)波長(zhǎng)及發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)物質(zhì)定性測(cè)定，利用熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測(cè)定。二、實(shí)驗(yàn)步驟樣品池激發(fā)單色器光源1．儀器結(jié)構(gòu)：　　　　　　　　　　　　　發(fā)射單色器檢測(cè)器記錄儀2．實(shí)驗(yàn)設(shè)備與實(shí)驗(yàn)藥品日立850型熒光分光光度計(jì)0.05M硫酸硫酸奎寧3．儀器基本操作CPUXelampMain穩(wěn)壓器（1）開(kāi)機(jī)：（2）基本參數(shù)調(diào)整EntershiftInstruparamater光標(biāo)選擇基本參數(shù)有：bandpass（

2、帶通）、ScanSpeed（掃描速度）、response（響應(yīng)時(shí)間）、PMGain（增益）、EMFilter（發(fā)射單色器）、Recording（記錄方式）（3）記錄儀定幅調(diào)整EntershiftRECSCALE定輻參數(shù)：Ordinate（縱坐標(biāo)）、Abscissa（橫坐標(biāo)）、Zeroshift（零點(diǎn)位置）。(4)激發(fā)光譜掃描Ex一側(cè)Gotoλ200Pre-Scan到達(dá)800nm后Pre-ScanRetureStart/Stop到達(dá)800nm后Start/Stop(5)發(fā)射光譜掃描Em一側(cè)Gotoλ200Pre-Scan到達(dá)800nm后Pre-ScanRet

3、ureStart/Stop到達(dá)800nm后Start/Stop(6)差減掃描（扣背景掃描）DATAPROCESSSUDTRACTIONBACKGROUNDENTER按EM或EX一側(cè)的START/STOP掃描完成后再按START/STOP停止SHIFTSUBTRACTIONENTER按EM或EX一側(cè)的START/STOP開(kāi)始差減掃描，自動(dòng)停止。（7）關(guān)機(jī)CPUMain關(guān)電源實(shí)驗(yàn)二分子熒光光譜法測(cè)定二氯熒光素一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解分子的電子結(jié)構(gòu)、振動(dòng)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)動(dòng)結(jié)構(gòu)2.掌握熒光光譜分析法的基本原理,學(xué)會(huì)利用工作曲線(xiàn)進(jìn)行熒光定量分析的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理??二氯熒光素

4、的化學(xué)式為C20H10C12O5,可以用熒光光度法定量測(cè)定。對(duì)于稀溶液，在實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，同一物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與其濃度成正比。本實(shí)驗(yàn)用工作曲線(xiàn)法分析試樣中的二氯熒光素含量。具體方法是：配制一系列不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)其熒光強(qiáng)度，然后以濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制工作曲線(xiàn)。在與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的條件下測(cè)未知試樣的熒光強(qiáng)度，從工作曲線(xiàn)上即可查出試樣中熒光物質(zhì)的濃度。三、儀器和試劑1.儀器（1）M-850熒光光度計(jì)（2）1.00cm石英測(cè)定池（3）25ml容量瓶8個(gè)（4）移液管：2.0ml1支5.00ml1支10.00ml1支（5）刻度管：10ml1支2.

5、試劑二氯熒光素標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液(25μg/ml):稱(chēng)取0.0125g二氯熒光素（A.R），用0.01mol·L－1NaOH溶液溶解后移入500ml容量瓶中并用0.10mol·L－1NaOH稀釋至刻度。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.二氯熒光素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液及未知試樣溶液的配制：??取5個(gè)50ml容量瓶，分別加入上述二氯熒光素溶液配置成0.00，1.00，2.00，4.00，6.00μg/ml2.啟動(dòng)熒光光度計(jì)3.發(fā)射光譜和激發(fā)光譜的繪制??在熟悉熒光分析儀的性能和操作方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)溶液及未知式樣溶液的實(shí)際情況，測(cè)取發(fā)射光譜和激發(fā)光譜并找出最大發(fā)射波長(zhǎng)和

6、最大激發(fā)波長(zhǎng)。4.熒光強(qiáng)度的測(cè)量??根據(jù)繪制的發(fā)射光譜和激發(fā)光譜，學(xué)生自行設(shè)計(jì)定量分析的儀器參數(shù)，繪制工作曲線(xiàn)，求出未知溶液的濃度。五、結(jié)果處理??將打印的未知溶液的兩個(gè)結(jié)果取平均值，在由平均值求出原始試樣中的濃度。