產(chǎn)甘露聚糖酶解淀粉芽孢桿菌的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

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1、產(chǎn)甘露聚糖酶解淀粉芽孑旬桿菌的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化摘耍：從海底淤泥中篩選出一株產(chǎn)高活性B-廿露聚糖酶的菌株，經(jīng)16SrDNA序列分析表明，該序列與解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的16SrDNA序列同源性為100%,將該菌株命名為BacillusamyloliquefaciensT27。對該菌株產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化，以魔芋粉為碳源，酵母粉為氮源，裝液量為50mL,250r/min.37°C培養(yǎng)24h,發(fā)酵液中粗酶活力能達到98.0U/mLo關(guān)鍵詞：解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)；#露聚糖；

2、甘露聚糖酶中圖分類號:TQ925+.9文獻標(biāo)識碼:A文章編號:0439-8114(2013)13-3105-04目前，在全球能源危機、糧食缺乏及環(huán)境保護越發(fā)重要的情況下，甘露聚糖酶在食品、造紙、印染、紡織等許多方面都具有重要作用［1-4］oB-甘露聚糖酶能特異性水解甘露糖類半纖維素，產(chǎn)生大量甘露寡糖和少量甘露糖［5］。該酶廣泛存在于植物、動物、微牛物屮［6］,其中微生物來源的廿露聚糖酶具有易于大規(guī)模生產(chǎn)、來源穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低等特點，因此，尋找發(fā)掘能夠產(chǎn)甘露聚糖酶的微生物資源備受人們關(guān)注。山于T業(yè)生產(chǎn)中要求所使用的甘露聚糖酶具有較強的穩(wěn)定性、耐熱性及耐酸堿等特性，

3、普通土壤環(huán)境下微生物產(chǎn)生的酶很難滿足這一要求。海洋尤其深海環(huán)境特殊，包括了高壓、低溫、高鹽、極端pH等，這一特殊環(huán)境中蘊藏著大量的稀有微生物資源。由于深海微生物產(chǎn)生的酶往往具有耐高溫、耐高壓和耐鹽堿等特點[7],在一些較為苛刻的工業(yè)環(huán)境屮表現(xiàn)出極大的應(yīng)用價值。因此，從海洋微生物中發(fā)掘新的酶資源受到越來越多的關(guān)注。本研究從海底淤泥中篩選到一株產(chǎn)甘露聚糖酶的海洋細菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定該菌株為解淀粉芽抱桿菌(Bac訂lusamyloliquefaciens),并初步研究了該菌株的最佳產(chǎn)酶條件，為進一步利用該海洋菌株生產(chǎn)甘露聚糖酶奠定了基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1

4、.1樣品與試劑海底淤泥樣品取自廈門深海；TaqDNA聚合酶、PCR試劑、DNAMarker等均購自寶生物工程(大連)有限公司；槐豆膠、低熔點瓊脂、蛋白月東和酵母粉購自英國Oxoid公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他試劑均為分析純。1.1.2培養(yǎng)基1)選擇培養(yǎng)基。魔芋粉20.0g,酵母膏20.0g,NaCl6.0g,MgS04-7112()1.0g,KH2P041.0g,(NH4)2S042.0g,蒸憾水1000.0mL,pH7.5。2)種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)。蛋白月東10.0g,NaCl10.0g,酵母膏5.0

5、g,蒸謂水1000.0mL,pH7.201.2方法1.2.1產(chǎn)甘露聚糖酶菌株的篩選與鑒定取約2g泥樣加入到100mL蒸館水中浸泡2h左右，取適量泥樣懸液稀釋，不同濃度梯度分別涂布在固體選擇培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)2d后，用0.1%剛果紅染色10min后棄去染液，用蒸憎水洗脫，選出透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株［8］。將篩選出的甘露聚糖酶高產(chǎn)菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)12?16h,提取細菌基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用細菌16SrDNA通用引物（fPl：5Z-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3

6、7,rP2：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-37）,PCR擴增所篩選出菌株的16SrDNA,PCR反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性5min；94°C變性30s,60°C退火30s,72°C延伸100s,30個循環(huán)；72°C延伸7min0將測序（測序交由華大基因公司完成）后的序列通過與GenBank中登錄的基因序列進行BLAST比對，確定篩選出的菌株的種屬。1.2.2甘露聚糖酶的活力測定采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定還原糖含量［9］。取10pL甘露聚糖酶加入到90pL0.5%槐豆膠底物，55°C反應(yīng)30min,然后加入100uLDNS終止

7、反應(yīng)，沸水浴lOmin,冷卻后加蒸憾水定容至1mL,再取200pL加至96孔板中，測定0D540nmo1.2.3產(chǎn)甘露聚糖酶菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化①培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響。250mL三角瓶裝入50mL液體選擇培養(yǎng)基，接種2%的種子培養(yǎng)液，置于37°C的搖床，轉(zhuǎn)速為250r/min培養(yǎng)12、24、48h取樣測定酶活。②培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響。250mL三角瓶裝入50mL液體選擇培養(yǎng)基，接種2%的種子培養(yǎng)液，置于28、37°C的搖床，轉(zhuǎn)速為200r/min培養(yǎng)24h后取樣測定酶活。③碳源對產(chǎn)酶的影響。250mL三角瓶裝入50mL以魔芋粉和槐豆膠為不同碳源的液體選擇培養(yǎng)基，分

8、別接種2%的種子培養(yǎng)液，