產(chǎn)淀粉酶菌株鑒定及酶的制備開題報(bào)告

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1、開題報(bào)告產(chǎn)淀粉酶菌株鑒定及酶的制備1選題的背景和意義淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的統(tǒng)稱，是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑品種。它是最重要的工業(yè)用酶之一，廣泛應(yīng)用于各種淀粉轉(zhuǎn)化為糖漿，以環(huán)糊精為產(chǎn)品的制藥行業(yè)，這些酶約占全球酶產(chǎn)量的30％。除動(dòng)物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外兩大來源是植物和微生物，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的主要是微生物淀粉酶。淀粉酶不僅可以簡化液化、糖化過程，降低淀粉深加工的生產(chǎn)成本，還可用于麥芽糖漿的生產(chǎn)、開發(fā)新型助消化劑以及工業(yè)廢液處理等多個(gè)領(lǐng)域，包括淀粉酶、異構(gòu)酶、果膠酶和纖維素酶等糖

2、酶所占的市場份額約為40％。而食品和飲料行業(yè)利用90％的糖酶進(jìn)行生產(chǎn)，因此淀粉酶具有巨大的應(yīng)用前景。隨著社會(huì)需求的增大，工業(yè)生產(chǎn)對α-淀粉酶的需求量越來越大，其在各領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，急需具更高活性的淀粉酶制劑。生物發(fā)酵法生產(chǎn)淀粉酶只是解決了“豐產(chǎn)”的問題，但要最大限度地創(chuàng)造出物質(zhì)財(cái)富，必須還要從下游分離工程（酶的分離純化）解決“豐收”的問題。通常處理的發(fā)酵液或酶反應(yīng)液中淀粉酶的濃度一般很低，提取時(shí)所耗費(fèi)的能量就很大，費(fèi)用也就很高，同時(shí)淀粉酶是生化活性物質(zhì)，易受環(huán)境因素如溫度、pH、金屬離子和微生物等的影響，甚至失活，而在很多情況下，特別是醫(yī)藥產(chǎn)

3、品和作為生物試劑用的產(chǎn)品，其最終產(chǎn)品的純度要求很高，有些產(chǎn)品要求是有一定保存期的穩(wěn)定的無色晶體。因此，下游工程往往要比其他生產(chǎn)過程需要更多的設(shè)備，耗用更多的能源及操作費(fèi)用。酶的分離純化常在整個(gè)用發(fā)酵法生產(chǎn)酶產(chǎn)品的生產(chǎn)成本上占主要部分，如果終產(chǎn)物純度要求相當(dāng)高時(shí)更是如此。對于傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)來說，其分離和提純所占費(fèi)用約為總投資的60%，而對于基因工程菌的發(fā)酵，甚至達(dá)到整個(gè)生產(chǎn)投資的80%-90%。所以認(rèn)真地研究和優(yōu)化發(fā)酵液中淀粉酶的分離純化工藝對工業(yè)降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益至關(guān)重要。2相關(guān)研究的最新成果及動(dòng)態(tài)62.1產(chǎn)淀粉酶菌株的研究淀粉酶是由

4、植物、動(dòng)物和微生物產(chǎn)生的。微生物來源，即真菌和細(xì)菌淀粉酶，鑒于其成本低、穩(wěn)定、用時(shí)少、生產(chǎn)空間省和便于工藝改造和優(yōu)化等優(yōu)點(diǎn)在工業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。芽孢桿菌被廣泛用于耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)。如枯草芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌和淀粉液化芽孢桿菌均能很好地生產(chǎn)α-淀粉酶，同時(shí)已被廣泛用于各種應(yīng)用酶的商業(yè)生產(chǎn)。曲霉屬于真菌，也是最常用的α-淀粉酶的生產(chǎn)菌之一。但隨著各行業(yè)對淀粉酶的需求不斷加大，且需要性能更穩(wěn)定酶活更高或具適應(yīng)生產(chǎn)的新特征的酶。因此，現(xiàn)研究重點(diǎn)放在了篩選耐酸性或熱穩(wěn)定性強(qiáng)的高產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)生菌上。運(yùn)用基因工程、酶工程的手段

5、，將不同的真菌和細(xì)菌來源的α-淀粉酶基因使用合適的載體已被克隆到適當(dāng)?shù)氖荏w生物體中，使其得到高表達(dá)或研究新特征。如在地衣芽孢桿菌中，將Asn172、His156和分別突變成Arg、Tyr和Thr，使α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性提高了5倍。2.2淀粉酶分離純化方法的研究高純度α-淀粉酶是一種重要的水解淀粉類酶制劑，可用于研究酶反應(yīng)機(jī)理和測定生化反應(yīng)平衡常數(shù)等。分離純化α-淀粉酶的方法很多，一般都是依據(jù)酶分子的大小、形狀、電荷性質(zhì)、溶解度、穩(wěn)定性、專一性結(jié)合位點(diǎn)等性質(zhì)建立的。要得到高純度的α-淀粉酶，往往需要將各種方法聯(lián)合使用。鹽析沉淀、凝膠過濾層析、

6、離子交換層析、疏水作用層析、親和層析和電泳等，是蛋白質(zhì)分離純化的主要方法。用吸附樹脂法、40%乙醇從α-淀粉酶發(fā)酵液中分離高活性α-淀粉酶，用離子交換法和透析法對初酶液進(jìn)行脫鹽處理，最后用DEAE－纖維素純化α－淀粉酶，所得酶活力為60153U/g，酶活性回收率為66.04%。另通過乙醇沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析等方式，從白曲霉菌A.kawachii的米曲粗抽出液中，分離純化到兩個(gè)耐酸性α-淀粉酶比活性極高的組分。用疏水吸附法和DEAE-cellulose(二乙氨基乙基-纖維素)柱層析法分離純化α-淀粉酶，所得酶活力為110000U/

7、g。用硫酸銨沉淀和垂直板制備凝膠電泳對地衣芽孢桿菌A.4041耐高溫α-淀粉酶進(jìn)行分離純化，得到3種電泳均一的組分。通過超濾、濃縮、脫鹽和聚丙烯酰胺垂直板凝膠電泳，對利用基因工程菌生產(chǎn)的重組超耐熱耐酸性α-淀粉酶進(jìn)行純化，得到電泳純級的超耐熱耐酸性α-淀粉酶，純化倍數(shù)為11.7，活力回收率為29.8%。但上述方法存在的共同問題是，連續(xù)操作和規(guī)模放大都比較困難。雙水相技術(shù)具有處理容量大、能耗低、易連續(xù)化操作和工程放大等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用雙水相系統(tǒng)PEG/磷酸鹽分離純化α-淀粉酶，增加PEG濃度有助于酶富集上相。同樣用PEG/磷酸鹽雙水相體系從發(fā)酵液中

8、直接萃取分離低溫α-淀粉酶，分配系數(shù)及回收率分別為4.68和87%。PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和硫酸銨對酶活力具有保護(hù)作用，利用PVP/硫酸銨液-固萃取體系分離提取耐高溫α-淀粉酶