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《包涵體變性 復性及純化的具體講析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、一、菌體的裂解?1、怎樣裂解細菌？?細胞的破碎方法?1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。?2.玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。?3.超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處
2、理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施，時間以及超聲間歇時間、超聲時間可以自己調(diào)整，超聲完全了菌液應(yīng)該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察。對超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應(yīng)慎用。?4.反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。?5.化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好，我用的濃度一般為1mg/ml。?無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細
3、胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應(yīng)該在破碎的同時多加幾次；另外，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。?這是標準配方:裂解液：50mM?Tris-HCl(pH8.5~9.0),?2mM?EDTA,?100mM?NaCl,?0.5%?Triton?X-100,?1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在這個p
4、H范圍內(nèi)比較好發(fā)揮作用)但我個人的經(jīng)驗是:如果你裂解細菌是為了提取蛋白的話,而且蛋白的分子量又小于20kd的話,盡量減少溶菌酶的用量,會引入溶菌酶這種雜蛋白.一般配60ml裂解液用藥匙匙柄盛一點就夠.判斷裂解好壞的標準是,溶液很粘.protocol是10ml-50ml緩沖液(菌體洗滌液,裂解液等)/1g濕菌體.如果只做一個鑒定,我覺得100-200ml菌就夠了.但凡超聲,我都用60ml裂解液,因為我們的超聲儀(現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù)錄象里的那種)很適合用100ml小燒杯,裝60ml裂解液,這樣能讓超聲頭離液面不高不低,不會冒泡泡,也不會灑出來.菌多我
5、就延長超聲時間.沉淀,也就是包涵體沉淀了,如果要上柱純化,一定要先用4M尿素洗滌一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑電泳,可以直接用8M尿素溶解以后,離心取上清,加入適量體積的loading?buffer.loading?buffer對于包涵體的溶解能力是較弱的."取200微升菌液，離心后直接加上樣buffer，100度3分鐘后上樣，然后SDSPAGE.?這個方法到底能不能溶解細菌中的包涵體??"而樓主的問題,雖然loading?buffer對于包涵體的溶解能力是較弱的,但是我覺得你的做法只是在鑒定有無表達,用loading?buffer是沒有
6、問題的.?2、表達重組蛋白時，細菌裂解方法都有哪些？?在表達重組蛋白時，誘導以后跑SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)表達都很好，但是在裂解細胞時遇到問題?？偸遣荒軓氐琢呀饧毎?。?首先我采用超聲裂解，可是不管我如何超聲總有部分細菌沒有裂解。?我的超聲條件如下：寧波新芝超聲細胞破碎儀，功率400W，超5秒，間隔5秒，重復99次。然后顯微鏡觀察，不徹底時再重復99次。菌體來自200?ml培養(yǎng)液，用20?ml?PBS重懸。?然后我又嘗試加溶菌酶，首先加至終濃度100?ug/ml，4C半小時菌液不變粘，加大濃度至1?mg/ml，半小時后仍無明顯變化。因為我用的PBS是pH7
7、.4，我懷疑是pH不合適，換用pH8.0?TE?buffer，1?mg/ml溶菌酶，4C半小時仍無明顯變粘。因為這次使用的溶菌酶是前一天配好的，擔心溶菌酶失效，重新稱取凍干粉末，直接加入菌液，仍然沒有明顯變化。?真是郁悶。到底出了什么事？請高手解答，并介紹優(yōu)化的方案。?同時希望能介紹一下如何選擇細胞破碎方法，以及如何確定最佳條件。?溶菌酶在pH7.4時是否沒有活性了？可否配成濃縮液保存溶菌酶，如果可以，應(yīng)如何保存？?加入溶菌酶以后，如果細胞壁已破壞，菌液應(yīng)該變粘吧，因為核酸被釋放出來。?而超聲破碎細胞，我覺得菌液是不會變粘的，因為超聲可以把大分子核酸
8、打碎成小片段。?我判斷細胞破碎不完全是因為，在將破碎后樣品離心分離上清和沉淀跑SDS-PAGE觀察，發(fā)現(xiàn)在細
