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《包涵體變性親和層析復(fù)性方法》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、包涵體變性及親和層析復(fù)性方法實驗材料裂解液:20mMTris-HCl,50mMNaCl,pH8.0洗滌液:20mMTris-HCl,10mMEDTA,3M尿素,pH8.0變性液:20mMTris-HCl,8M尿素,0.5MNaCl,20mM咪唑,pH8.5洗脫液:20mMTris-HCl,8M尿素,500mM咪唑,pH8.5復(fù)性液:20mMTris-HCl,50mMNaCl,0.1ML-Arg,0.5mMGSH,0.05mMGSSG,5%甘油,1%PEG實驗方法:1.包涵體的變性:收集菌體,加入裂解
2、液,高壓破碎,12000rpm離心30min,沉淀中加入包涵體洗滌液,充分溶解,12000rpm離心30min取沉淀,加入變性液(1g包涵體加入15ml),碾壓包涵體,置于室溫充分溶解,12000rpm離心30min取上清。2.包涵體的純化:上述變性液上樣至5mlNi柱,用變性液平衡,用pH4.5的20mMNaAc緩沖液洗滌三個柱體積,然后用含有55mM,100mM及500mM咪唑的含8M尿素的洗脫液階段梯度洗脫,每個梯度至少洗五個柱體積。3.包涵體的復(fù)性:上述洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,然后用
3、變性液調(diào)節(jié)其濃度至0.5mg/ml左右。再透析至含有4M尿素的復(fù)性液中,10℃透析6h,然后透析至含有2M尿素的復(fù)性液中,透析8h;再透析至含有1M尿素的復(fù)性液中,透析12h;最后透析至儲存緩沖液(20mMTris-HCl.50mMNaCl,20%甘油,pH8.0)中。5000rpm離心10min,取上清進(jìn)行還原膠及非還原膠鑒定,并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)檢測。