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《包涵體變性親和層析復(fù)性方法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、包涵體變性及親和層析復(fù)性方法實驗材料裂解液：20mMTris-HCl,50mMNaCl,pH8.0洗滌液：20mMTris-HCl,10mMEDTA,3M尿素，pH8.0變性液：20mMTris-HCl,8M尿素，0.5MNaCl，20mM咪唑，pH8.5洗脫液：20mMTris-HCl,8M尿素，500mM咪唑，pH8.5復(fù)性液：20mMTris-HCl,50mMNaCl,0.1ML-Arg,0.5mMGSH,0.05mMGSSG,5%甘油，1%PEG實驗方法：1.包涵體的變性：收集菌體，加入裂解
2、液，高壓破碎，12000rpm離心30min，沉淀中加入包涵體洗滌液，充分溶解，12000rpm離心30min取沉淀，加入變性液（1g包涵體加入15ml），碾壓包涵體，置于室溫充分溶解，12000rpm離心30min取上清。2.包涵體的純化：上述變性液上樣至5mlNi柱，用變性液平衡，用pH4.5的20mMNaAc緩沖液洗滌三個柱體積，然后用含有55mM,100mM及500mM咪唑的含8M尿素的洗脫液階段梯度洗脫，每個梯度至少洗五個柱體積。3.包涵體的復(fù)性：上述洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，然后用
3、變性液調(diào)節(jié)其濃度至0.5mg/ml左右。再透析至含有4M尿素的復(fù)性液中，10℃透析6h，然后透析至含有2M尿素的復(fù)性液中，透析8h；再透析至含有1M尿素的復(fù)性液中，透析12h;最后透析至儲存緩沖液(20mMTris-HCl.50mMNaCl,20%甘油,pH8.0)中。5000rpm離心10min,取上清進(jìn)行還原膠及非還原膠鑒定，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)檢測。
