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《應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)的新方法.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、第30卷第3期暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)Vo.l30No.32009年6月JournalofJinanUniversity(NaturalScience)Jun.2009應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)的新方法萬(wàn)艷,李麗玲,陳小佳(暨南大學(xué)生物工程研究所,廣東廣州510632)[摘要]介紹一種采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法鑒定重組細(xì)胞株基因組中外源基因拷貝數(shù)的方法.首先根據(jù)研究對(duì)象建立標(biāo)準(zhǔn)品,以擬檢測(cè)的外源基因設(shè)計(jì)特定的引物,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后在不同重組細(xì)胞株中對(duì)外源基因進(jìn)行Rea-lTimePCR鑒定,根據(jù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)得出實(shí)際的拷貝數(shù)
2、.結(jié)果表明:以轉(zhuǎn)染sPDGFRA基因的重組CHO-K1細(xì)胞為例,采用該方法,利用標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高的擴(kuò)增效率和良好的線性關(guān)系,并且具有較大的線性15范圍(10-10拷貝);測(cè)得各重組細(xì)胞株外源基因拷貝數(shù)不同,3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)表明結(jié)果一致.與傳統(tǒng)雜交技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)相比,該方法具有高效省時(shí)、更穩(wěn)定、高通量和低成本等優(yōu)點(diǎn).[關(guān)鍵詞]外源基因;拷貝數(shù);實(shí)時(shí)定量PCR[中圖分類號(hào)]R735.7[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1000-9965(2009)03-0310-04Anewmethodtoteterminethecopynumberso
3、fexogenousgenebyabsolutequantitativeRea-lTimePCRassayWANYan,LIL-iling,CHENXiao-jia(BioengineeringInstituteofJinanUniversity,Guangzhou510632,China)[Abstract]Toexploreanewmethodtodeterminethecopynumbersofexogenousgeneclonedinmam-malcellgenomebyusingtheabsolutequantitativeRea-
4、lTimePCR.Firstly,withspecificprimerstoam-plythetargetgene,thestandardsamplesweresetup.Then,toamplytheexogenousgeneinrecombinantmammalcellgenomebyRea-lTimePCR.Comparetostandardsamples,theircopynumbersweredeter-mined.TheresultsshowthattotakeexogenoussPDGFRAasexample,itscopynu
5、mbersinCHO-K1ge-nomeweredetermined.InRea-ltimePCRresults,standardcurveshowedaverygoodlinearrelationship1betweenthresholdcycle(Ct)andstartingquantityofcopynumber.Thedetectionrangewasfrom10to510copiesperreaction.DifferentrecombinantCHO-K1celllineshavedifferentexogenoussPDGFRA
6、copynumbers.Furthermore,theresultsindicatedahighstabilityandreproducibilityofexamplesaccord-ingtothreeindependentexperiments.Comparewithtraditionalhybridizationassayssuchassouthernblo,titisamoreefficientandconvenientmethodtoestimatecopynumbersingenome.[Keywords]exogenousgen
7、e;copynumber;Rea-lTimePCR哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白是基因工程制藥研需經(jīng)過(guò)重組表達(dá)載體的設(shè)計(jì)構(gòu)建,轉(zhuǎn)染,篩選和鑒定究中的一個(gè)重要內(nèi)容,一般而言,重組細(xì)胞株的獲得等一系列步驟.目前鑒定工作主要集中在測(cè)定外源[收稿日期]2008-12-31[基金項(xiàng)目]廣東省科技攻關(guān)項(xiàng)目(200813030301349)[作者簡(jiǎn)介]萬(wàn)艷(1982-),女,碩士研究生,研究方向:基因工程制藥通訊作者:陳小佳,Te:l020-85220220;電子郵件:Carolcx@jmsn.cn第3期萬(wàn)艷,等:應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)的新方法
8、311基因的表達(dá)水平,尋找高效表達(dá)的重組細(xì)胞株.由應(yīng)條件為:65e5min,30e10min,42e60min,于在轉(zhuǎn)染過(guò)程中,外源DNA被隨機(jī)插入宿主細(xì)胞基72e
