實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)畢赤酵母基因組中外源基因拷貝數(shù)

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1、·1236·中國(guó)生物制品學(xué)雜志2009年12月第22卷第12期ChinJBiologicalsDecember2009，Vol.22No.12中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)Q789文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1004-5503（2009）12-1236-05【實(shí)驗(yàn)技術(shù)】實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)畢赤酵母基因組中外源基因拷貝數(shù)宣姚吉周祥山張?jiān)d【摘要】目的建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)畢赤酵母基因組中外源基因拷貝數(shù)的方法。方法采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，分別利用含有GAP基因和綠色熒光蛋白（GFP）基因的質(zhì)粒，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將含有外源GFP基因的畢赤酵母基因組進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲

2、線計(jì)算出外源GFP基因在畢赤酵母基因組中的拷貝數(shù)。結(jié)果畢赤酵母GAP基因Ct值與起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)的回歸方程為：y=-3.612x+39.28，GFP基因Ct值與起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)的回歸方程為：y=-3.544x+37.99，GAP基因和GFP基因的反應(yīng)效率分別為0.89和0.90，兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均為0.999，且均有良好的重復(fù)性。檢測(cè)10個(gè)轉(zhuǎn)入GFP基因的畢赤酵母菌株，篩選到9個(gè)單拷貝整合GFP基因的菌株和1個(gè)多拷貝整合GFP基因的菌株。結(jié)論已建立了檢測(cè)畢赤酵母基因組中外源基因拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，該方法能夠篩選出不同外源基因拷貝數(shù)的畢赤酵母菌株?！娟P(guān)鍵詞】實(shí)時(shí)熒光定

3、量PCR；畢赤酵母；基因拷貝數(shù)DeterminationofCopyNumberofForeignGeneinGenomeofPichiapastorisbyReal-timeFluorescentQuantitativePCRXUANYao-ji,ZHOUXiang-shan,ZHANGYuan-xing（StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChi－naUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China）【Abstract】ObjectiveTodevelopame

4、thodfordeterminationofthecopynumberofforeigngeneingenomeofPichiapastorisbyreal-timefluorescentquantitativePCR.MethodsThestandardcurvesofGAPandGFPgenesweregeneratedwiththeplasmidscontainingGAPandGFPgenesrespectively,andthegenomicDNAofP.pastoristransformantscontainingGFPgenewasanalyzedbyreal-t

5、imefluorescentquantitativePCR.ThecopynumberofGFPgeneineachtransformantwascalculatedwiththeCtvalueofP.pastorisgenomicDNAandthestandardcurve.ResultsTheregressionequationofCtvalueandlogarithmoforiginalcopynumberofGAPgenewasy=-3.612x+39.28,whilethatofGFPgenewasy=-3.544x+37.99.Thereactionefficien

6、ciesofGFPandGAPgeneswere0.89and0.90respectively.However,boththecorrelationcoefficientsofstandardcurvesofthetwogeneswere0.999,andboththecurvesshowedgoodreproducibility.OfthetenP.pastoristransformantstested,ninecontainedonecopyandonecontainedmultiplecopiesofGFPgene.ConclusionAreal-timefluoresc

7、entquantitativePCRmethodwassuccessfullydeveloped,whichmightbeusedforscreeningofP.pastoristransformantscontainingvariouscopiesofforeigngenes.【Keywords】Real-timefluorescentquantitativePCR;Pichiapastoris;Genecopynumber［3］在畢赤酵母中，外源基因能夠在基因組的同一數(shù)。但相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較