免疫學(xué)概論-第章-抗原和抗體制備與應(yīng)用.ppt

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1、第一節(jié)天然抗原的制備一、顆粒天然抗原的制備二、可溶性抗原的制備一、顆粒天然抗原的制備1.細(xì)菌抗原2.血紅細(xì)胞抗原和組織細(xì)胞粗抗原的制備1.細(xì)菌抗原(多用液體或固體培養(yǎng)物集菌后處理)1)H抗原(鞭毛抗原，蛋白質(zhì)）:用有毒力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛處理2)O抗原（菌體抗原，細(xì)胞壁多糖抗原）:需要100℃加溫2～2.5h后應(yīng)用。3)Vi抗原（傷寒沙門菌的表面抗原，糖脂）：應(yīng)在殺菌后再加0.5％～1％氯化鈣溶液。有些細(xì)胞膜成分，如組織細(xì)胞膜、血細(xì)胞膜經(jīng)打碎后亦可制成顆?？乖?。顆?？乖瓚乙撼嗜闈釥睿嗖捎渺o脈內(nèi)免疫法，較少使用佐劑作皮內(nèi)注射。細(xì)菌菌體抗原的制備流程圖液體培養(yǎng)或

2、斜面培養(yǎng)富集菌體37℃24h100℃水浴2～2.5h殺菌無(wú)菌試驗(yàn)NS稀釋成8～10億/mlO菌體抗原返回4)菌苗用細(xì)菌體制成的生物制品a.活菌苗：制備關(guān)鍵:獲得減毒或無(wú)毒菌株，但應(yīng)保持免疫原性。優(yōu)點(diǎn);一般只需接種一次，且需量較小，但引起的免疫效果好，能維持較長(zhǎng)時(shí)間。缺點(diǎn):活菌苗需維持其活力，菌苗的保存需一定的冷藏條件，且有效期短。實(shí)例：預(yù)防結(jié)核病的卡介苗、鼠疫活菌苗等。b.死菌苗b.死菌苗制備關(guān)鍵：用化學(xué)或物理方法將病原菌殺死后仍可保持免疫原性特點(diǎn):病原菌已被殺死，不能繁殖，用量較大，接種后可能出現(xiàn)局部腫痛或發(fā)熱等全身反應(yīng);大多需多次接種。實(shí)例：霍亂、傷寒、副傷寒甲、乙混合菌苗

3、、百日咳菌苗等。2.血紅細(xì)胞抗原和組織細(xì)胞粗抗原的制備綿羊紅細(xì)胞抗原的制備組織和細(xì)胞粗抗原的制備綿羊紅細(xì)胞的制備流程圖搖動(dòng)15-20min4℃可保存3周取適量NS洗滌3次2000r/min10minNS稀釋至2～5%抗凝血?jiǎng)┨烊豢鼓齽ǜ嗡兀〤a+2鰲合劑（檸檬酸鈉，氟化鉀）有溶血現(xiàn)象應(yīng)棄去2）組織和細(xì)胞粗抗原的制備處理好的組織用生理鹽水洗去血跡及污染物。將洗凈的組織剪成小塊，進(jìn)行粉碎。組織勻漿后通過(guò)2000～3000r/min離心10min后分成兩個(gè)部分沉淀物含有大量的組織細(xì)胞和碎片---組織和細(xì)胞粗抗原；上清液作為提取可溶性抗原的材料，提取前還要通過(guò)1000～2000r/m

4、in20～30min的高速離心，以除去微小的細(xì)胞碎片，此時(shí)上清液應(yīng)澄清來(lái)源:組織和細(xì)胞，其成分比較復(fù)雜1.組織和細(xì)胞成分混合抗原制備2.蛋白質(zhì)抗原制備3.核酸抗原制備4.類脂多糖抗原制備5.免疫球蛋白片段制備二、可溶性抗原制備及鑒定可溶性抗原:蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶類、補(bǔ)體、脂多糖、細(xì)菌外毒素和核酸二、可溶性抗原制備及鑒定1.組織和細(xì)胞成分混合抗原制備程序上清液澄清所用材料必須是新鮮或低溫保存的去除包膜或結(jié)締組織臟器進(jìn)行灌洗洗去血跡及污物NS內(nèi)含0.5g／LNaN2冷浴中組織剪碎裝入搗碎機(jī)簡(jiǎn)內(nèi)高速粉碎制成組織勻漿液3000r／min×10min取上清液去除細(xì)胞碎片及微小組織

5、離心蛋白質(zhì)抗原制備蛋白質(zhì)是良好的抗原，要制備特異性高的抗血清通常需要純化。可采用：1.超速離心法2.選擇性沉淀法3.凝膠層析法4.離子交換層析法5.親合層析法2.蛋白質(zhì)抗原制備（自學(xué)）原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內(nèi)，達(dá)到彼此分離的目的。1)．超速離心法特點(diǎn)：用超速離心或梯度密度離心法純化抗原，極難將某一抗原成分分離出來(lái)。應(yīng)用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗原物質(zhì)的分離，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白、載脂蛋白A、B等。2、選擇性沉淀法原理：根據(jù)各蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉

6、淀，從而達(dá)到純化的目的。2)、選擇性沉淀法常用方法：鹽析沉淀法（不同鹽濃度則溶解度不同）；常用33～50％飽和度的硫酸胺。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單方便，純度不高，粗提球蛋白。應(yīng)用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。3．凝膠層析法（凝膠過(guò)濾法）原理：凝膠具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，經(jīng)適當(dāng)溶液平衡后，裝入層析柱。當(dāng)含有各種分子大小不一的混合物加在凝膠床面時(shí)，大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙中很快地通過(guò)凝膠床，短時(shí)間內(nèi)被洗脫出來(lái)；而分子較小的物質(zhì)則進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，反復(fù)受到阻滯，洗脫較慢。分成大、中、小三種類型。3)．凝膠層析法（凝膠過(guò)濾法）原理：利用帶離子基團(tuán)的

7、纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所帶電荷不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。當(dāng)梯度洗脫時(shí)，逐步增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個(gè)部分而被洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的。4)．離子交換層析法5．親和層析法（親和色譜）原理：依據(jù)抗原抗體的生物學(xué)活性進(jìn)行分離和提純的技術(shù)。將純化的抗IgG附著于惰性的固相基質(zhì)上，制成免疫吸附層析柱。當(dāng)樣品流過(guò)此柱時(shí)，待分離的IgG可選擇性