瓊脂打孔法抑菌圈試驗.docx

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1、瓊脂打孔法（瓊脂打孔抑菌圈實驗）一、試驗原理利用抑菌劑不斷溶解經瓊脂擴散形成不同濃度梯度，以顯示其抑菌作用。試驗通過抑菌圈大小以判斷其是否具有抑菌能力。本試驗適用于抑菌劑與溶出性抗（抑）菌產品的鑒定。二、試驗器材、化學試劑及菌種培養(yǎng)皿、試管、5uL～50uL微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的槍頭、10mL離心管、游標卡尺、涂布棒、麥氏比濁管、電動混合器、水浴鍋、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、鼓風干燥箱、生化培養(yǎng)箱、電熱爐營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PBS緩沖液、無菌水、95%乙醇。菌種：溶血性鏈球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、結核分枝桿菌、白喉棒狀桿菌、吸附性

2、綠膿桿菌、大腸桿菌三、試驗步驟1、實驗工器具準備及滅菌在錐形瓶中配置營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用電熱爐加熱煮沸至澄清狀態(tài)，蓋好塞子，同PBS緩沖液、無菌水、配套槍頭、涂布棒、離心管一同放入高壓滅菌鍋中滅菌，121℃殺菌25min。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好和試管一起放入鼓風干燥箱中滅菌，170℃殺菌2h。實驗前超凈工作臺及操作室使用前需用紫外燈殺菌30min以上。2、倒培養(yǎng)皿將培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿放置到60℃后開始倒培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基使用前搖勻，每個培養(yǎng)皿倒15～20mL左右，倒好后水平靜置至完全凝固。3、菌懸液的制備從冰箱取出需要測試的菌種活化0.5h后，加入5mL的PBS緩沖液將斜面上

3、，在手掌上輕輕振打80次，使菌株完全沖下，倒入試管中輕輕搖勻。吸取1mL的菌液加入到4mL的PBS緩沖液中，再吸取1mL稀釋的菌懸液依次進行5倍梯度稀釋，選擇108CFU/mL左右的菌懸液或106CFU/mL左右的孢子懸浮液（對比0.5麥氏比濁管），將選好的菌懸液十倍系列稀釋后選第二支試管（即濃度約為106/CFU/mL左右的菌懸液或104CFU/mL左右的孢子懸浮液）進行試驗。4、試驗菌的接種用移液槍吸取濃度為106cfu/mL試驗菌懸液0.1mL，將其接種到已經倒好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿內，用涂布棒涂布均勻（注意涂布棒每次使用后在酒精燈下滅菌，涂布時動作輕不要刮破培

4、養(yǎng)基），蓋好培養(yǎng)皿。5、抑菌劑的配置用分析天平準確稱量1g樣品于滅菌后的15mL離心管內，加入10mL溶劑（無菌純水、95%乙醇等），搖勻使溶解（根據情況可使用電動混合器搖勻或放入水浴鍋中加熱使溶解）。溶解后吸取上清液對倍稀釋樣品，可根據情況決定稀釋幾次，一般稀釋6～10次。若樣品是液體，可直接對倍稀釋。6、添加抑菌劑6.1在培養(yǎng)皿上打三個孔，用10～100uL的槍頭打孔，打完孔用無菌針頭將瓊脂孔中的培養(yǎng)基挑出（打孔時一次打孔，不能轉動槍頭，以防瓊脂圈裂縫，影響藥液擴散以致抑菌圈不均勻，每次無菌針頭挑完后都要酒精燈燒一下滅菌）。各孔中心之間相距25mm以上，與培養(yǎng)

5、皿的周緣相距15mm以上。用微量移液器吸取抑菌劑20uL到瓊脂孔內（三個孔為一組），蓋好培養(yǎng)皿。6.2用不加抑菌劑的培養(yǎng)皿、加入配抑菌劑時的溶劑做陽性對照，用未接種菌的培養(yǎng)皿做陰性對照。7、培養(yǎng)培養(yǎng)皿并觀察抑菌效果于37℃生化培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)，培養(yǎng)16h～18h觀察結果。用游標卡尺測量抑菌圈的直徑并記錄。注：每個培養(yǎng)皿做一個濃度，測量抑菌圈時，應選均勻而完全無菌生長的抑菌圈進行。測量其直徑應以抑菌圈外沿為界。四、試驗結果各濃度抑菌劑抑菌圈直徑（mm）抑菌劑濃度123平均值陽性對照結果：陰性對照結果：五、評價規(guī)定1、抑菌作用的判斷:抑菌圈直徑小于或等于7mm者，判為

6、無抑菌作用。抑菌圈直徑大于7mm者，判為有抑菌作用。大于7mm小于10mm判為鈍敏；大于10mm小于20mm判為中敏；大于20mm為高敏。2、3次重復試驗均有抑菌作用結果者，判為合格。3、注意事項(1)接種用細菌懸液的濃度應符合要求。濃度過低，接種菌量少，抑菌圈常因之增大;濃度過高，接種量過多，抑菌圈則可減小。(2)應保持瓊脂濃度的準確性，否則可影響抑菌圈的大小。(3)培養(yǎng)時間不得超過18h。培養(yǎng)過久，部分細菌可恢復生長，抑菌圈變小。(4)抑菌圈直徑可受抑菌劑的量、抑菌性能和干濕度影響。