瓊脂打孔法抑菌圈試驗(yàn).docx

《瓊脂打孔法抑菌圈試驗(yàn).docx》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、瓊脂打孔法（瓊脂打孔抑菌圈實(shí)驗(yàn)）一、試驗(yàn)原理利用抑菌劑不斷溶解經(jīng)瓊脂擴(kuò)散形成不同濃度梯度，以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)通過抑菌圈大小以判斷其是否具有抑菌能力。本試驗(yàn)適用于抑菌劑與溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的鑒定。二、試驗(yàn)器材、化學(xué)試劑及菌種培養(yǎng)皿、試管、5uL～50uL微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的槍頭、10mL離心管、游標(biāo)卡尺、涂布棒、麥?zhǔn)媳葷峁?、電?dòng)混合器、水浴鍋、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、鼓風(fēng)干燥箱、生化培養(yǎng)箱、電熱爐營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PBS緩沖液、無菌水、95%乙醇。菌種：溶血性鏈球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、結(jié)核分枝桿菌、白喉棒狀桿菌、吸附性

2、綠膿桿菌、大腸桿菌三、試驗(yàn)步驟1、實(shí)驗(yàn)工器具準(zhǔn)備及滅菌在錐形瓶中配置營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用電熱爐加熱煮沸至澄清狀態(tài)，蓋好塞子，同PBS緩沖液、無菌水、配套槍頭、涂布棒、離心管一同放入高壓滅菌鍋中滅菌，121℃殺菌25min。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好和試管一起放入鼓風(fēng)干燥箱中滅菌，170℃殺菌2h。實(shí)驗(yàn)前超凈工作臺(tái)及操作室使用前需用紫外燈殺菌30min以上。2、倒培養(yǎng)皿將培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿放置到60℃后開始倒培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基使用前搖勻，每個(gè)培養(yǎng)皿倒15～20mL左右，倒好后水平靜置至完全凝固。3、菌懸液的制備從冰箱取出需要測(cè)試的菌種活化0.5h后，加入5mL的PBS緩沖液將斜面上

3、，在手掌上輕輕振打80次，使菌株完全沖下，倒入試管中輕輕搖勻。吸取1mL的菌液加入到4mL的PBS緩沖液中，再吸取1mL稀釋的菌懸液依次進(jìn)行5倍梯度稀釋，選擇108CFU/mL左右的菌懸液或106CFU/mL左右的孢子懸浮液（對(duì)比0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽?，將選好的菌懸液十倍系列稀釋后選第二支試管（即濃度約為106/CFU/mL左右的菌懸液或104CFU/mL左右的孢子懸浮液）進(jìn)行試驗(yàn)。4、試驗(yàn)菌的接種用移液槍吸取濃度為106cfu/mL試驗(yàn)菌懸液0.1mL，將其接種到已經(jīng)倒好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿內(nèi)，用涂布棒涂布均勻（注意涂布棒每次使用后在酒精燈下滅菌，涂布時(shí)動(dòng)作輕不要刮破培

4、養(yǎng)基），蓋好培養(yǎng)皿。5、抑菌劑的配置用分析天平準(zhǔn)確稱量1g樣品于滅菌后的15mL離心管內(nèi)，加入10mL溶劑（無菌純水、95%乙醇等），搖勻使溶解（根據(jù)情況可使用電動(dòng)混合器搖勻或放入水浴鍋中加熱使溶解）。溶解后吸取上清液對(duì)倍稀釋樣品，可根據(jù)情況決定稀釋幾次，一般稀釋6～10次。若樣品是液體，可直接對(duì)倍稀釋。6、添加抑菌劑6.1在培養(yǎng)皿上打三個(gè)孔，用10～100uL的槍頭打孔，打完孔用無菌針頭將瓊脂孔中的培養(yǎng)基挑出（打孔時(shí)一次打孔，不能轉(zhuǎn)動(dòng)槍頭，以防瓊脂圈裂縫，影響藥液擴(kuò)散以致抑菌圈不均勻，每次無菌針頭挑完后都要酒精燈燒一下滅菌）。各孔中心之間相距25mm以上，與培養(yǎng)

5、皿的周緣相距15mm以上。用微量移液器吸取抑菌劑20uL到瓊脂孔內(nèi)（三個(gè)孔為一組），蓋好培養(yǎng)皿。6.2用不加抑菌劑的培養(yǎng)皿、加入配抑菌劑時(shí)的溶劑做陽性對(duì)照，用未接種菌的培養(yǎng)皿做陰性對(duì)照。7、培養(yǎng)培養(yǎng)皿并觀察抑菌效果于37℃生化培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)，培養(yǎng)16h～18h觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑并記錄。注：每個(gè)培養(yǎng)皿做一個(gè)濃度，測(cè)量抑菌圈時(shí)，應(yīng)選均勻而完全無菌生長的抑菌圈進(jìn)行。測(cè)量其直徑應(yīng)以抑菌圈外沿為界。四、試驗(yàn)結(jié)果各濃度抑菌劑抑菌圈直徑（mm）抑菌劑濃度123平均值陽性對(duì)照結(jié)果：陰性對(duì)照結(jié)果：五、評(píng)價(jià)規(guī)定1、抑菌作用的判斷:抑菌圈直徑小于或等于7mm者，判為

6、無抑菌作用。抑菌圈直徑大于7mm者，判為有抑菌作用。大于7mm小于10mm判為鈍敏；大于10mm小于20mm判為中敏；大于20mm為高敏。2、3次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用結(jié)果者，判為合格。3、注意事項(xiàng)(1)接種用細(xì)菌懸液的濃度應(yīng)符合要求。濃度過低，接種菌量少，抑菌圈常因之增大;濃度過高，接種量過多，抑菌圈則可減小。(2)應(yīng)保持瓊脂濃度的準(zhǔn)確性，否則可影響抑菌圈的大小。(3)培養(yǎng)時(shí)間不得超過18h。培養(yǎng)過久，部分細(xì)菌可恢復(fù)生長，抑菌圈變小。(4)抑菌圈直徑可受抑菌劑的量、抑菌性能和干濕度影響。