小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備及提取.doc

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1、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備及提取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-8周的SPF級(jí)雄性BALB/C小鼠，小鼠取細(xì)胞前三天每天腹腔注射0.5-1mL淀粉肉湯，或者取細(xì)胞前一小時(shí)注射1mL淀粉肉湯。試劑：75%乙醇、RPMI1640（Gibcol/BRL，美國(guó)）、含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、鏈霉素10μg/ml)步驟：1、取6周左右的小鼠，剃去腹部的毛并消毒。2、引頸殺死動(dòng)物，手提鼠尾將全鼠浸入75%酒精中3～5秒。3、倒立小鼠，置動(dòng)物于解剖臺(tái)上，固定四肢，75%酒精擦洗腹膜壁后，用9號(hào)針

2、頭5ml注射器沿腹中線將預(yù)冷的不含小牛血清的PBS5mL注入腹腔中，同時(shí)從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)。輕輕按摩腹部2-3分鐘，靜置5-7分鐘。4、無(wú)菌條件下，剪開腹壁，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。再用75%酒精擦洗腹壁。5、用針頭輕輕挑起腹壁，使動(dòng)物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸入注射器內(nèi)。小心拔出針頭。把液體注入50ml離心管中。再用同樣容量的PBS沖洗腹腔2～4次。合并滲出液于50mL離心管中。直至沖洗液變澄清。6、4℃250×g（1000rpm/m

3、in）離心10min，去上清。7、用PBS培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，每次4℃250×g（1000rpm/min）離心10min，去上清。8、用含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、鏈霉素10μg/ml)懸浮細(xì)胞。將調(diào)整細(xì)胞濃度調(diào)整至5×106cells/mL加入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)9、將培養(yǎng)皿置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h，然用37℃預(yù)溫的RPMI-1640培養(yǎng)液清洗培養(yǎng)皿2-3次，去除未貼壁的細(xì)胞，即得到純化的貼壁巨噬細(xì)胞。種96孔板。2h細(xì)胞貼壁。換液。墨汁（時(shí)間短，可

4、以不滅菌）染色。觀察。