(精選)小鼠巨噬細(xì)胞的制備與培養(yǎng).doc

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1、小鼠巨噬細(xì)胞的制備與培養(yǎng)一、目的:建立一種簡(jiǎn)便的巨噬細(xì)胞分離與培養(yǎng)方法，為骨替代材料降解產(chǎn)物的研究提供巨噬細(xì)胞。二、方法:以無血清DMEM培養(yǎng)液灌洗小鼠腹腔,10min后吸出灌洗液于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。采用HE染色和倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);酸性磷酸酶及非特異性酯酶染色測(cè)定細(xì)胞內(nèi)酶的表達(dá);墨汁顆粒吞噬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其吞噬功能。三、結(jié)果:獲得高純度的巨噬細(xì)胞，具有巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征，良好的吞噬功能，含水解酶類。四、結(jié)論:本法是一種簡(jiǎn)易而實(shí)用的體外分離培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞的方法。巨噬細(xì)胞是機(jī)體的重要防御細(xì)胞。大量研究己證明巨噬細(xì)胞具有吞噬與清除異物及分泌生物活性物質(zhì)等

2、廣泛的生物學(xué)作用。為了深入研究□噬細(xì)胞對(duì)仿生全降解Ca2P材料降解后的無機(jī)產(chǎn)物參與生命過程中有機(jī)物的合成作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)己有腹腔巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)方法加以改良，建立了一種簡(jiǎn)便而經(jīng)濟(jì)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。1材料與方法1.1主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Hycolon)氧化碳培養(yǎng)箱(美國FormaCo.),倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus1X250）。1.2小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)脫頸處死628周齡昆明種小鼠（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供）,75%酒精浸泡5min后，倒立小鼠并腹腔注入無血清DMEM培養(yǎng)液5ml,仰臥平放并輕揉小鼠腹部223m

3、in,靜置527min后，無菌條件下打開小鼠腹腔，觀察腸管變扁且腹腔液為淡黃色時(shí)，用注射器抽取腹腔液約424.5ml,離心洗滌后顯微鏡下計(jì)數(shù)，常規(guī)DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，青霉素100U/ml,鏈霉素100Pg/ml）調(diào)整細(xì)胞至所需濃度，接種于培養(yǎng)瓶及放有無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，置于37°C,5%CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)12h后換液，以去掉少數(shù)未貼壁細(xì)胞。1.3培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢查1.3.1活細(xì)胞形態(tài)觀察細(xì)胞培養(yǎng)后每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及牛:長(zhǎng)狀況。1.3.2HE染色細(xì)胞培養(yǎng)3d后取出，PBS洗3次，甲醛固定,常規(guī)HE染色，中性樹膠封固。1.4細(xì)胞吞噬功能

4、檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)7d后行墨汁吞噬試驗(yàn)，在培養(yǎng)體系中加入10%墨汁50?1,放回培養(yǎng)箱中孵育，3h后取出蓋玻片，PBS沖洗，甘油明膠封片。鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其吞噬率。1.5細(xì)胞的酶化學(xué)檢測(cè)1.5.1酸性磷酸酶染色將培養(yǎng)325d的細(xì)胞以Gomori酸性磷酸酶（ACP）硫化鉛法染色，陽性反應(yīng)為棕黃色或棕黑色顆?；蚱瑝K狀沉淀，定位于細(xì)胞胞漿屮。光鏡下毎張載片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，求出陽性率。1.2.2a2醋酸奈酚酯酶染色（a2ANE）培養(yǎng)527d的細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗后，于冷甲醛2丙酮緩沖液中固定10215min,流水沖洗后，入孵育液（10mga2醋酸奈酯溶于0.4ml丙酮中，加入1

5、/15mol/LPBS40ml,再加入六偶氮副品紅2.4ml混合，pH5?8）,37°C孵育lh,流水沖洗，2%甲綠復(fù)染細(xì)胞核，甘油明膠封片。酶活性部位為彌漫性紅棕色產(chǎn)物。光鏡下每張載片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，求出陽性率。1結(jié)果2.1分離培養(yǎng)的活細(xì)胞觀察培養(yǎng)24h后，鏡下可觀察到貼壁細(xì)胞呈圓形、橢圓形、三角形或不規(guī)則形，有偽足和突起。在培養(yǎng)過程中未見細(xì)胞有絲分裂相，因而細(xì)胞不增殖。培養(yǎng)30d后，絕大部分細(xì)胞仍然存活，細(xì)胞形態(tài)基本不變。2.2HE染色光鏡觀察可見細(xì)胞形狀多樣，界限清楚，有鈍圓形突起。胞漿豐富，含許多顆粒及少量空泡。核大為卵圓形、腎形、馬蹄形或不規(guī)則形，偏居于細(xì)胞的

6、一端，著色較深。2.3培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定將培養(yǎng)7天的細(xì)胞做3h的吞噬試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)墨汁顆粒有很強(qiáng)的吞噬作用，吞噬率為95.68%o酸性磷酸酶及非特異性酯酶的陽性率也很高，分別為89.66%和85.19%o2討論隨著體外分離培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，巨噬細(xì)胞的提取方法有多種，細(xì)胞來源有豬、兔、大鼠、小鼠等，又由于研究目的不同，在體內(nèi)提取細(xì)胞的部位也不盡相同，如提取肺血管巨噬細(xì)胞、腎小球巨噬細(xì)胞，骨髓基質(zhì)□噬細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞等。本實(shí)驗(yàn)選擇來源容易又便宜的小鼠，提取其腹腔巨噬細(xì)胞。從大量文獻(xiàn)可知腹腔巨噬細(xì)胞的提取方法雖然大致都是灌洗腹腔后，吸出含巨噬細(xì)胞的灌洗液，但具體操作也略有

7、差異。有人先注入腹腔巨噬細(xì)胞刺激劑（如肉湯、淀粉、糖原、礦物油、蛋口腺等），以產(chǎn)牛:大量的巨噬細(xì)胞進(jìn)入腹腔。就研究巨噬細(xì)胞的功能這-?目的而言，雖然此法能收集到大量的巨噬細(xì)胞，但獲得的巨噬細(xì)胞已不在是原體內(nèi)巨噬細(xì)胞的功能基礎(chǔ)，因而在一定程度上限制了巨噬細(xì)胞的應(yīng)用。而本實(shí)驗(yàn)免去了抗原物質(zhì)的準(zhǔn)備和注入的繁瑣工作,同時(shí)避免了注入的大分子抗原物質(zhì)對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，只通過增加易得而乂便宜的小鼠數(shù)量，并注意操作時(shí)關(guān)鍵的幾點(diǎn)，就可解決巨噬細(xì)胞數(shù)量少的問題，而且此方法有混入雜細(xì)胞比較少的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)提取巨噬細(xì)胞的方法，關(guān)鍵在于以下幾點(diǎn)