作者姓名趙亮.doc

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1、作者姓名：趙亮論文題目：人結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析及候選蛋白LASP-1功能的初步研究作者簡(jiǎn)介：趙亮，男，1981年08月出生，2007年09月師從于南方醫(yī)科大學(xué)丁彥青教授，于2009年06月獲博士學(xué)位。中文摘要結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。近些年來(lái)，雖然隨著診療新技術(shù)的應(yīng)用和化療藥物的不斷更新，結(jié)直腸癌患者的治療得到了極大地改善，但患者的生存率并沒(méi)有顯著地提高，主要原因是多數(shù)結(jié)直腸癌患者在行根治性手術(shù)前已出現(xiàn)了微轉(zhuǎn)移。因此，篩選和鑒定在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中起重要

2、作用的關(guān)鍵分子，尋找早期診斷的生物標(biāo)志物和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物靶點(diǎn)，闡明腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移機(jī)制，是提高結(jié)直腸癌患者生存率和治愈率的關(guān)鍵問(wèn)題，也是當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，腫瘤轉(zhuǎn)移的全過(guò)程受以下幾個(gè)因素的調(diào)控：1、在轉(zhuǎn)移啟動(dòng)初期E-cadherin、Ig超家族、選擇素、整合素等參與腫瘤細(xì)胞間的脫離以及腫瘤細(xì)胞與胞外基質(zhì)的粘附；2、腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞分泌的蛋白水解酶及其抑制劑，在降解胞外基質(zhì)和血管的基底膜過(guò)程中發(fā)揮重要作用；3、在運(yùn)動(dòng)因子、生長(zhǎng)因子、歸巢因子等的作用下，腫瘤細(xì)

3、胞遷移到轉(zhuǎn)移靶器官；4、血管增生因子VEGF、bFGF、IL-8、PDGF等促進(jìn)新生血管的形成，伴隨著腫瘤細(xì)胞的增生，形成新的轉(zhuǎn)移灶，完成轉(zhuǎn)移過(guò)程。鑒于目前對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究往往針對(duì)單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)分子以及關(guān)注基因水平的改變，缺乏系統(tǒng)性和綜合性的分析，因此在所有這些調(diào)控因素中，究竟哪些分子在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，仍有待闡明。近年來(lái)開(kāi)展的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為揭示腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制帶來(lái)了新的希望。在前期研究中，我們以人結(jié)直腸癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用高通量的雙向凝膠電泳聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的比較蛋白質(zhì)組學(xué)策略，鑒定了

4、11個(gè)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的候選蛋白，其中SW620細(xì)胞株表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有磷酸甘油酸變位酶1，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白和高遷移率族蛋白B-1，而熱休克蛋白27，膜聯(lián)蛋白I，甲硫腺苷磷酸化酶，切絲蛋白1和表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白在SW620中表達(dá)下調(diào)。大多數(shù)差異蛋白功能涉及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、粘附、凋亡等過(guò)程，研究結(jié)果為闡明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及尋找預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物提供了理論依據(jù)。然而一種標(biāo)志物僅能在細(xì)胞株中檢測(cè)得到，那么它在早期診斷及預(yù)后判斷方面的臨床價(jià)值無(wú)法得到體現(xiàn)。因此本研究采用高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

5、，在組織水平通過(guò)比較結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展不同階段臨床標(biāo)本的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，尋找結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，為闡明結(jié)直腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移機(jī)理，尋找腫瘤早期診斷和治療的靶標(biāo)提供重要理論依據(jù)。1、人結(jié)直腸癌組織的蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳分析為了更好的理解結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移機(jī)理，尋找結(jié)直腸癌預(yù)后的標(biāo)志分子，我們運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)結(jié)直腸癌和配對(duì)正常結(jié)直腸粘膜組織進(jìn)行了差異表達(dá)雙向凝膠電泳分析，軟件分析normal和CRC蛋白質(zhì)表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)36個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在兩組凝膠中有顯著性差異表達(dá)(p<0.05)，其中在CRC組中

6、表達(dá)升高的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)有17個(gè)，在CRC組中表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)有12個(gè)；定性差異表達(dá)分析(量相差10倍以上)有5個(gè)僅在CRC組中表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，有3個(gè)僅在normal組中檢測(cè)到。結(jié)腸癌組織根據(jù)是否伴發(fā)轉(zhuǎn)移分為不伴發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌(Non-metastasticCRC，nmCRC)和伴發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌(MetastaticCRC，mCRC)，通過(guò)比較它們?nèi)鞍踪|(zhì)表達(dá)譜差異，有13個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在mCRC組中表達(dá)升高，其中4個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)僅在mCRC組中檢測(cè)到。2、雙向凝膠電泳差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定和免疫印跡驗(yàn)證

7、以結(jié)直腸正常粘膜和腫瘤組織為研究對(duì)象，采用2-DE分離技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒定了22個(gè)結(jié)直腸癌相關(guān)蛋白，其中9個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在CRC組織中表達(dá)下調(diào)，它們分別被鑒定為熱休克蛋白70、細(xì)胞角蛋白20、丙酮酸激酶同工酶、轉(zhuǎn)膠蛋白。13個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在CRC組織中表達(dá)上調(diào)，它們分別被鑒定為纖維蛋白原、Maspin、LIM和SH3蛋白1、鈣粒蛋白B、RhoGDP解離抑制因子α、磷酸甘油酸變位酶1、mRNA結(jié)合蛋白AUF1、熱休克蛋白90、鈣磷脂結(jié)合蛋白III和蛋白酶體α亞基3。以不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本為研究對(duì)象，蛋白質(zhì)

8、組學(xué)技術(shù)篩選得到了11個(gè)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，它們分別被鑒定為熱休克蛋白90、轉(zhuǎn)膠蛋白、RhoGDP解離抑制因子α、原肌球蛋白、膜聯(lián)蛋白V、CC趨化因子受體5、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、IgE依賴(lài)組胺釋放因子、熱休克蛋白27和乳酸酰谷胱苷肽裂解酶。我們還采用跡免疫印跡技術(shù)對(duì)差異蛋白在蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證，并探討了候選差異蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。篩選得到的差異蛋白絕大部分蛋白都與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移等行為相關(guān)，涉及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、