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1、大黃中蒽醌類成分的提取、分離和鑒別一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆蛰祯赵奶崛》椒ā崴夥āＵ莆站彌_紙色譜的原理及基本操作技術(shù)。掌握pH梯度萃取法的原理及操作技術(shù)。通過(guò)大黃酚和大黃素甲醚的分離實(shí)驗(yàn)，熟悉柱色譜的操作技術(shù)。熟悉蒽醌類化合物的鑒定方法。二、基本原理大黃中羥基葸醌類化合物多數(shù)以苷的形式存在，故先用稀硫酸溶液把蒽醌苷水解成苷元，利用游離葸醌可溶于熱氯仿的性質(zhì)，用氯仿將它們提取出來(lái)。由于各羥基葸醌結(jié)構(gòu)上的不同所表現(xiàn)的酸性不同，用pH梯度萃取法分離它們；大黃酚和大黃素甲醚酸性相近，利用其極性的差別，用柱色譜分離之。三、操作要點(diǎn)1.提取、分離流程（如圖一）2.總蒽
2、醌苷元的提取大黃粗粉100g，加20％硫酸溶液300ml潤(rùn)濕，再加氯仿500ml，回流提取2hr，稍冷后過(guò)濾，殘?jiān)鼦壢?，氯仿提取液于分液漏斗中，分出酸水層，得氯仿提取液。圖1.大黃提取分離流程圖3.蒽醌苷元的分離和精制（1）蒽醌類成分的緩沖紙色譜試驗(yàn)為了驗(yàn)證分離所采用的萃取液是否合理，作如下緩沖紙色譜試驗(yàn)：取層析濾紙3cm×12cm，距下端2cm處劃一起始線，向上每隔1.5cm劃一平行線，在各條帶上依pH由低至高順次涂布實(shí)際所用的各緩沖液及堿液，涂布完后，將濕濾紙夾在兩片干濾紙中吸至半干。取樣品總蒽醌苷元氯仿提取液點(diǎn)在起始線上，用氯仿上行展開(kāi)，將結(jié)果繪制在
3、下面圖中，并確定選擇的萃取劑是否合理。（2）分離與精制a.大黃酸的分離和精制將含有總蒽醌的氯仿液450ml于1000ml分液漏斗中，加pH8緩沖液150ml充分振搖，靜置至徹底分層，分出堿水層置250ml燒杯中，在攪拌下滴加20％鹽酸至pH3，待沉淀析出完全后，過(guò)濾，并用少量水洗沉淀物至洗出液呈中性，沉淀干燥后，樣品加冰醋酸10ml加熱溶解，趁熱過(guò)濾，濾液放置析晶，過(guò)濾，用少量冰醋酸淋洗結(jié)晶，得黃色針晶為大黃酸。b.大黃素的分離和精制pH8緩沖液萃取過(guò)的氯仿層，用pH9.9緩沖液300ml振搖萃取，靜置至徹底分層后，分出堿水層，在攪拌下用20％鹽酸酸化至p
4、H3，析出棕黃色沉淀，抽濾，水洗沉淀物至洗出液呈中性，沉淀經(jīng)干燥后，用15ml丙酮熱溶，趁熱過(guò)濾，濾液靜置，析出橙色針晶，過(guò)濾后，用少量丙酮淋洗結(jié)晶，得大黃素。c.蘆薈大黃素的分離與精制pH9.9萃取過(guò)的氯仿層再加5％碳酸鈉-5％氫氧化鈉（9:1）堿水液540ml萃取，堿水層加鹽酸酸化，析出的沉淀水洗，干燥，用10ml乙酸乙酯精制，得黃色針晶的蘆薈大黃素。d.大黃酚和大黃素甲醚的分離萃取除去蘆薈大黃素后余下的氯仿層，再用3％氫氧化鈉溶液500m1分二次萃取，至堿水層無(wú)色為止，合并堿水層，加鹽酸酸化至pH3，析出黃色沉淀，過(guò)濾，水洗至中性，干燥，為大黃酚和大
5、黃素甲醚混合物，留作柱色譜分離的樣品。余下氯仿液水洗至中性，蒸餾回收氯仿。e.硅膠柱色譜法分離大黃酚、大黃素-6-甲醚裝柱：用石油醚－乙酸乙酯（9.8:0.2）浸泡200～300目硅膠約20g，攪拌均勻，盡量趕出氣泡。一次性倒入1.8cmX28cm的層析柱中，輕輕敲打使硅膠均勻下沉，至硅膠界面不再下降為止。上樣：將離大黃酚和大黃素-6-甲醚的混合物用乙醇加熱溶解，伴入少量硅膠，水浴60℃左右烘干，加到已裝好的硅膠柱頂端，最后在樣品帶上蓋上一層硅膠或棉花，以保護(hù)樣品界面不受干擾。洗脫：先用100ml石油醚－乙酸乙酯（9.8:0.2）洗脫，至第一條黃色色帶洗下
6、來(lái)，再換用100ml石油醚－乙酸乙酯（9.5:0.5）洗脫下第二條色帶。4.鑒定(1)蒽醌類成分化學(xué)鑒定a.堿液試驗(yàn)分別取各蒽醌結(jié)晶數(shù)毫克置于小試管中，加2％氫氧化鈉溶液lml，觀察顏色變化。凡有互成鄰位或?qū)ξ涣u基的蒽醌呈藍(lán)紫至藍(lán)色，其它羥基蒽醌呈紅色。b.醋酸鎂試驗(yàn)分別取蒽醌結(jié)晶數(shù)毫克，置于小試管中，各加乙醇lml使溶解，滴加0.5％醋酸鎂乙醇溶液，觀察顏色變化。(2)色譜鑒識(shí)a.薄層板：硅膠G-CMC-Na板。b.點(diǎn)樣：提取的大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的氯仿溶液及各對(duì)照品氯仿溶液。c.展開(kāi)劑：石油醚－乙酸乙酯－甲酸（15:5:1）上
7、層溶液。d.展開(kāi)方式：上行展開(kāi)。e.顯色：在可見(jiàn)光下觀察，記錄黃色斑點(diǎn)出現(xiàn)的位置，然后用濃氨水熏或噴5%醋酸鎂甲醇溶液，斑點(diǎn)顯紅色。f.觀察記錄：記錄圖譜并計(jì)算Rf值。四、思考題1．大黃中5種羥基蒽醌化合物的酸性和極性大小應(yīng)如何排列?為什么?2．pH梯度法的原理是什么?適用于哪些中藥成分的分離?
