金黃色葡萄球菌

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金黃色葡萄球菌1簡(jiǎn)述金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）為葡萄球菌屬中的一種，廣泛分布于自然界，空氣、土壤、水及物品上，人和動(dòng)物皮膚及與外界相通的腔道中，也經(jīng)常有本菌存在。本菌可產(chǎn)生多種毒素及酶，這些毒性物質(zhì)引起局部及全身化膿性炎癥，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展成為敗血癥和膿毒血癥，是人類(lèi)化膿性感染中重要的病原菌。本菌抵抗力較強(qiáng)，干燥情況下能生存數(shù)月，80℃30min的條件下尚能存活，5%石炭酸或0.1%升汞溶液10～15min才會(huì)被殺死。金黃色葡萄球菌檢查按增菌、分離、純培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢和血漿凝固酶試驗(yàn)等步驟進(jìn)行。本法使用于外用藥品及一般滴眼劑、眼膏劑的檢查。2儀器、設(shè)備及用具（見(jiàn)大腸埃希菌2）。3試液、指示液3.10.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或pH7.2無(wú)菌磷酸鹽緩沖液[附錄3.1，3.5]。3.2pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液[附錄3.2]。3.3革蘭染色液[附錄2.4，2.10，2.16]。3.4無(wú)菌枸櫞酸納氯化鈉溶液[附錄2.7]。3.5血漿的制備以無(wú)菌注射器吸取滅菌的5%枸櫞酸納的0.9%的氯化鈉溶液1ml，用無(wú)菌操作采取家兔（或羊、人）血9ml，輕輕混勻數(shù)分鐘。待血液不凝固時(shí)，徐徐放入滅菌離心管中，及時(shí)離心（500r/min離心5min

10，分離血漿，用滅菌吸管將血漿轉(zhuǎn)移至滅菌試管中，置冰箱備用。臨用前必須用已知血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌（如金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]測(cè)試，證明血漿合格后，方可用于試驗(yàn)。3.61%酚磺酞指示液[附錄4.4]。4培養(yǎng)基4.1營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[附錄5.1]。4.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.2]。4.3亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基[附錄5.15]。4.4卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.16]。4.5甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.17]。5對(duì)照用菌液取金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，接種至5ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，按10倍遞增稀釋至1:106，加入含10～100cfu的對(duì)照菌菌液（一般用量為1:1060.1ml），同時(shí)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)。6操作方法6.1供試品的檢驗(yàn)量9見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)5.3）。6.2供試液的制備（見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7）。含抑菌成分供試品供試液的制備（見(jiàn)大腸埃希菌6.2）。6.3增菌培養(yǎng)取營(yíng)養(yǎng)肉湯（或亞碲酸鈉肉湯）培養(yǎng)基2份，每份100ml，1份加入10ml供試液，另一份加入與供試液等量的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為陰性對(duì)照，置36℃±1℃培養(yǎng)18～24h

2（必要時(shí)可延至48h）。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。6.4分離培養(yǎng)將上述供試品增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液，劃線(xiàn)接種于卵黃氯化鈉瓊脂平板或甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)24～72h。當(dāng)供試品分離平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，或有菌落生長(zhǎng)但不同于表1所列特征，可報(bào)告為1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。表1金黃色葡萄球菌在三種選擇性培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)特征卵黃氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)，外周有分解卵磷脂后產(chǎn)生的乳濁圈，菌落直徑1～2mm甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)，外周有黃色環(huán)，菌落直徑0.7～1mm6.5純培養(yǎng)當(dāng)供試品分離平板生長(zhǎng)菌落與表1所列菌落特征相似或疑似時(shí)，應(yīng)選取2～3個(gè)以上菌落，分別用接種針，輕輕沾取菌落中心表面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，于36℃±1℃培養(yǎng)18～24h，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭染色、鏡檢及接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂肉湯于36℃±1℃培養(yǎng)18～24h做血漿凝固酶試驗(yàn)。6.6革蘭染色、鏡檢6.6.1革蘭染色（見(jiàn)大腸埃希菌7.5）。6.6.2鏡檢金黃色葡萄球菌為革蘭陽(yáng)性球菌，無(wú)芽孢，一般不產(chǎn)生莢膜。排列呈不規(guī)則的葡萄狀，亦可呈單個(gè)、成雙或短鏈狀排列。

36.7血漿凝固酶試驗(yàn)試管法：取無(wú)菌試管（10mm×100mm）3支，各加入血漿和0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液（1:1）0.5ml，1支加入斜面培養(yǎng)物菌懸液（或被檢菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液）0.5ml，其余2支作對(duì)照管：1支加入金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]菌懸液或營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5ml作為陽(yáng)性對(duì)照；另1支加入營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對(duì)照。三管同時(shí)置36℃±1℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱，3h后開(kāi)始檢查，以后每隔適當(dāng)時(shí)間觀(guān)察一次，直至24h。檢查時(shí)，輕輕將試管傾斜，（動(dòng)作勿大）仔細(xì)觀(guān)察，陰性對(duì)照管血漿流動(dòng)自如，陽(yáng)性對(duì)照管液呈凝固狀，試驗(yàn)管液呈凝固者為陽(yáng)性反應(yīng)；不凝固為陰性反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管任何一管不符合要求時(shí)，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。7結(jié)果判定如果革蘭染色結(jié)果清晰可靠，凝固酶試驗(yàn)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)呈陽(yáng)性結(jié)果，供試品培養(yǎng)物按下列情況報(bào)告或處理：7.1疑似菌革蘭染色呈陽(yáng)性球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)者，報(bào)告1g或1ml供試品檢出金黃色葡萄球菌（少許菌株可能不是金黃色葡萄球菌而是葡萄球菌屬的其他菌種。如：中間葡萄球菌）。7.2革蘭染色鏡檢不是革蘭陽(yáng)性球菌，或血漿凝固酶試驗(yàn)陰性反應(yīng)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。7.3陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。7.4陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性結(jié)果，應(yīng)當(dāng)加做驗(yàn)證試驗(yàn)，考察檢品是否有抑菌活性。

48注意事項(xiàng)8.1金黃色葡萄球菌在上述兩種分離培養(yǎng)基上的典型菌落為金黃色。但由于受藥物影響或非典型菌株存在，亦可呈橙黃色、檸檬色或白色。做控制菌檢查，對(duì)非典型菌落也有必要進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)做金黃色葡萄球菌的篩查，以防漏檢金黃色葡萄球菌。培養(yǎng)基存放時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間影響色素產(chǎn)生，故培養(yǎng)基應(yīng)新鮮配制。培養(yǎng)時(shí)間宜48h以上。8.2如果使用干燥培養(yǎng)基，應(yīng)按說(shuō)明書(shū)配制，注意pH值是否符合規(guī)定，必要時(shí)應(yīng)校正pH后滅菌使用。8.3血漿凝固酶試驗(yàn)應(yīng)用新鮮培養(yǎng)物及新鮮血漿。如用陳舊培養(yǎng)物及血漿（纖維蛋白常已析出）易導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。此外，觀(guān)察結(jié)果時(shí)不要搖動(dòng)試管，因凝固初期凝塊易破壞，引起假陰性試驗(yàn)結(jié)果。8.4葡萄球菌屬在新版Bergey手冊(cè)中共收載為28種，在微生物菌種鑒定中目前應(yīng)用較多的2003年出版的第八版美國(guó)臨床微生物手冊(cè)共收錄35個(gè)菌種，44個(gè)菌型。常見(jiàn)有金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌三種?？蓞⒄毡?進(jìn)行鑒定。其中又以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的鑒別最為重要。表2三種葡萄球菌的主要性狀性狀金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌

5菌落色素主要為金黃色主要為白色主要為檸檬色大小（菌落直徑）0.8～1.0mm0.5～1.5mm0.5～1.5mmα溶血毒素＋－/極少＋－甘露醇需氧＋dd厭氧＋－－凝固酶＋－－卵黃反應(yīng)＋－－耐熱DNA酶＋－－對(duì)新生霉素敏感性SSR噬菌體分型多數(shù)能分型不能分型不能分型A蛋白＋－－致病性強(qiáng)弱或無(wú)注：d不定S敏感R耐藥8.5目前商品化的金黃色葡萄球菌檢測(cè)試劑，多家微生物相關(guān)制劑公司有售，試劑具有較好的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。商品化的檢測(cè)試劑應(yīng)當(dāng)在適當(dāng)?shù)臈l件下保存，在有效期內(nèi)應(yīng)用。（六）梭菌檢查法1簡(jiǎn)述梭菌屬（Clostridium）過(guò)去稱(chēng)為梭狀芽孢桿菌屬，菌體1μm×5μm

6左右的革蘭陽(yáng)性桿菌，能形成芽孢。芽孢多大于菌體的寬度，細(xì)菌膨脹呈梭形，故名梭狀芽孢桿菌。該菌屬中主要病原菌有產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens）破傷風(fēng)梭菌（C.tetani）肉毒梭菌（C.botulinum）和艱難梭菌（C.difficile）均能產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素使人和動(dòng)物致病。因此，對(duì)于某些用于陰道、創(chuàng)傷、潰瘍的藥品，必須控制梭菌。梭菌檢查方法主要是增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)和鏡檢形態(tài)觀(guān)察，分離培養(yǎng)及過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)等步驟。2儀器、設(shè)備及用具2.1玻璃器皿試管（30mm×200mm）等。洗滌干凈，無(wú)殘留抗菌物質(zhì)，包扎后，滅菌備用（見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)2.2.2）。2.2天平、離心機(jī)、顯微鏡、高壓蒸汽滅菌器、恒溫干燥箱（見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)2.2.1）。2.2.1天平、高壓蒸汽滅菌器、恒溫干燥箱等應(yīng)定期進(jìn)行校驗(yàn)。2.2.2厭氧培養(yǎng)箱（罐）有商品供應(yīng)。須經(jīng)測(cè)試后選用，亦可用真空干燥器（器內(nèi)徑240mm，全高360mm）或標(biāo)本瓶（口徑150mm，高350mm，蓋上需鉆一小孔）或其他適宜帶蓋能密封的容器代用。2.3無(wú)菌室或凈化工作臺(tái)（見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)2.1.1）。2.4手術(shù)鑷、手術(shù)剪及取樣匙，應(yīng)嚴(yán)密包扎，滅菌備用。3試液3.1革蘭染色液（附錄2.4，2.10，2.16）。3.2厭氧指示劑（附錄4.8）。3.33%過(guò)氧化氫溶液。

73.475%乙醇溶液。3.5碘酊溶液或碘伏。3.6pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（附錄3.2）。3.7苯扎溴胺（1:1000）溶液。4培養(yǎng)基4.1保存菌種用庖肉培養(yǎng)基（附錄5.29）。4.20.1%葡萄糖庖肉培養(yǎng)基（附錄5.30）。4.3含慶大霉素20mg/L的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基（附錄5.34）。5對(duì)照用菌液產(chǎn)氣莢膜梭菌[CMCC（B）64615]或破傷風(fēng)梭菌[CMCC（B）64067]或膿毒梭菌[CMCC（B）64857]菌種接種于庖肉培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后，涂片、染色、鏡檢，具典型梭菌形態(tài)的可作為菌種保存。該菌液置5～8℃保存。試驗(yàn)前取該菌液適量轉(zhuǎn)種至庖肉培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)72～96h后，即為對(duì)照用菌液。6操作方法6.1不同劑型陽(yáng)平的前處理6.1.1散劑除去包裝，直接稱(chēng)取規(guī)定量的樣品即可。6.1.2膠囊除去包裝，連殼一起稱(chēng)取規(guī)定量樣品。6.1.3軟膏劑及栓劑稱(chēng)取樣品10g（軟膏5g），按細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7.31規(guī)定的適宜方法乳化，乳化后加入預(yù)熱至45℃的0.9%無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液，制成1:20供試液。量取此液各10ml于3支滅菌離心管內(nèi)，以3000r/min離心30min

8，棄上層液，保留低部約2ml殘液。6.2厭氧培養(yǎng)裝置的準(zhǔn)備除商品厭氧培養(yǎng)箱、罐，按說(shuō)明要求準(zhǔn)備外，實(shí)驗(yàn)室亦可用真空干燥器、標(biāo)本瓶或其他適宜容器替代使用，可選用下列一種方法制備厭氧條件：6.2.1冷觸媒法臨用前，取試管或其他容器3支，1支稱(chēng)入硼氫化鈉0.22g（以厭氧培養(yǎng)容器容積1升計(jì)），1支稱(chēng)取枸櫞酸0.33g、碳酸氫鈉0.37g，另1支放入經(jīng)活化的鈀粒約1g，與接種后的供試品培養(yǎng)管（或平板）及厭氧指示劑管1支，同時(shí)置于厭氧培養(yǎng)容器內(nèi)，隨即各加水5ml于前2支容器中，迅速密封容器蓋。鈀粒為覆蓋鈀的氧化鋁的球狀或條狀顆粒（有商品出售），用前需經(jīng)160℃干烤2h，或在電爐上灼燒5min使其活化。由于每用1次便失去催化性，因此，再次使用時(shí)需按上法活化后方能使用。將鈀粒若干置室溫水中，有大量氣泡者為活性良好，可直接使用。此法可作為鈀粒的活性檢查。6.2.2焦性沒(méi)食子酸法用前，取培養(yǎng)皿或其他適宜容器1支，加入焦性沒(méi)食子酸10g及無(wú)水碳酸鈉5g（以厭氧容器容積1升計(jì)），與接種后的供試品培養(yǎng)管（或平板）及厭氧指示劑管1支同時(shí)置于厭氧容器內(nèi)，迅速密封容器蓋。6.3增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g或1ml）2份，分別加至0.1%葡萄糖庖肉培養(yǎng)基100ml管中，其中1份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。（若供試品為軟膏劑或栓劑，則無(wú)菌吸取乳化離心后的管底部約2ml殘液含供試品1.0g）。培養(yǎng)基若非當(dāng)日配制，應(yīng)于臨用前煮沸5min，迅速冷卻。取1支加0.05ml

9新鮮的對(duì)照用菌液作為陽(yáng)性對(duì)照。另取1支0.1%葡萄糖庖肉培養(yǎng)基加等量稀釋液作為陰性對(duì)照。以上兩管均置75～80℃水浴保溫10min，然后放置到厭氧培養(yǎng)裝置內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96h，觀(guān)察結(jié)果。陰性對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)為培養(yǎng)液混濁，倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生，碎肉有被消化變色并有惡臭等現(xiàn)象。陽(yáng)性對(duì)照管若無(wú)上述現(xiàn)象，應(yīng)研究原因，改進(jìn)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，或重新制備供試液，消除供試品中抑菌成分的影響。6.4革蘭染色、鏡檢取增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)液涂片，作革蘭染色、鏡檢，觀(guān)察染色及菌體特征。培養(yǎng)后形成的芽孢，有的在菌體末端初呈“火柴頭”狀卵圓形，繼而膨大呈球形，形如鼓槌狀。有的腰包卵圓形，位于菌體中央或次極端，不膨出菌體。培養(yǎng)時(shí)間至72h以上時(shí)，有的菌體自溶而消失，僅見(jiàn)游離的芽孢囊，一般染色時(shí)呈圓圈狀。革蘭染色幼齡菌為陽(yáng)性，老齡菌可變陰性。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)有上述典型特征的菌體形態(tài)出現(xiàn)。當(dāng)供試品培養(yǎng)管均不產(chǎn)氣、無(wú)消化碎肉及臭氣等現(xiàn)象，染色鏡檢未見(jiàn)疑似菌者，可報(bào)告1g或1ml供試品未檢出梭菌。若供試品培養(yǎng)管兩管（或僅有一管）產(chǎn)氣，消化碎肉并有臭氣，染色鏡檢有卵圓形至球形的芽孢，大于菌體，著生于菌體中央、次端或頂端，需進(jìn)一步分離、做過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。6.5分離培養(yǎng)取試驗(yàn)粗管的培養(yǎng)物分別劃線(xiàn)于含慶大霉素哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基表面，置厭氧裝置培養(yǎng)48～72小時(shí)，若無(wú)菌落生長(zhǎng)，判該供試品未檢出梭菌。若有菌落生長(zhǎng)，挑取每個(gè)不同形態(tài)的菌落做過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。

106.6過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)加一滴3%過(guò)氧化氫溶液至瓊脂表面的單個(gè)分散的菌落上，或加至轉(zhuǎn)移在載玻片上的菌落上。如有氣泡形成表示過(guò)氧化氫酶反應(yīng)陽(yáng)性。同時(shí)用枯草桿菌作為過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照菌。7結(jié)果判定若試驗(yàn)粗的庖肉培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁、產(chǎn)氣、消化碎肉、臭氣等現(xiàn)象；含慶大霉素哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落為革蘭陽(yáng)性梭菌，有卵圓形至球形的芽孢，大于菌體或不大于菌體，著生于菌體中央、次端或頂端；過(guò)氧化氫酶陰性，判供試品檢出梭菌。8注意事項(xiàng)8.1凡進(jìn)行梭菌檢驗(yàn)的人員，應(yīng)在半個(gè)月前注射破傷風(fēng)類(lèi)毒素進(jìn)行免疫，以后每隔6～12個(gè)月重復(fù)注射一次加強(qiáng)免疫力。操作時(shí)勿損傷皮膚，若有損傷，應(yīng)立即注射破傷風(fēng)抗毒素，以防感染。8.2凡帶有活菌及毒素的器具，應(yīng)在徹底滅菌后方可洗滌。