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《cbfa1定向調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、Cbfa1定向調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究【關(guān)鍵詞】Cbfa1定向【摘要】目的研究核心結(jié)合因子(Cbfa1)調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為成骨細(xì)胞的分子機(jī)制。方法用Perˉcoll密度梯度離心法分離獲得人、大鼠和小鼠的MSCs,通過HE、細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光及透射電鏡等方法進(jìn)行鑒定。傳代培養(yǎng)后的MSCs分別用重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/Cbfal-Ⅱ通過脂質(zhì)體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染,用NorthernBlot檢測三種成骨細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果轉(zhuǎn)染后人、大鼠和小鼠的MSCs都有骨鈣素、骨橋接蛋白和Ⅰ型膠原的表達(dá),三者間無明顯差別。結(jié)
2、論Cbfa1在轉(zhuǎn)錄水平定向調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞,可應(yīng)用于骨科疾患的基因治療。關(guān)鍵詞核心結(jié)合因子骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化.【Abstract】ObjectiveToinvestigatethemolecularregulationmechanismsofCbfaltodifferentiationofmesˉenchymalstemcells(MSCs)toosteoblast.MethodsMSCsefrombonemarroanbeings,ratsandmiceethodofPercolldensitygradientcentrifuging,andMSCsethods,
3、includingHE,cytochemistry,immunochemistry,immunofluorescenceanalysisandtransmissionelectronmicroscope.SubculturedMSCsofliposomes.NorthernBlotRNAsofextracellularmatrixproˉtein(ECMP)ofosteobalst.ResultsExpressionofosteocalcin,osteopontin,typeⅠcollagenmRNAsongthreedifferentMSCs.ConclusionCbfalcanregu
4、latedifferentiationfromMSCstoosteoblastontranscriptionlevel,andcanbeappliedtotreatorthopedicdiseases.Keyesenchymalstemcellsosteobalstdifferentiation骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有多分化潛能,在不同調(diào)控因子作用下可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等方向分化。其作為組織工程的種子細(xì)胞具有明顯的優(yōu)勢;通過自體骨髓穿刺即可獲得,副損傷輕微;分離篩選簡單,培養(yǎng)擴(kuò)增迅速;應(yīng)用范圍廣泛,可體外調(diào)控分化為所有中胚層的組織
5、;回植體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生組織配型和免疫排斥反應(yīng);無腫瘤化傾向;可避免倫理、法律等問題。MSCs向成骨細(xì)胞方向分化受一系列激素、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,其中起決定作用的是核結(jié)合因子α1(Cbˉfal),也稱成骨細(xì)胞特異性因子2(Osf2)。Cbfal可于轉(zhuǎn)錄水平使MSCs定向分化為成骨細(xì)胞,也可使軟骨細(xì)胞肥大化,進(jìn)而促進(jìn)軟骨內(nèi)化骨,表達(dá)骨鈣素、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原等成骨細(xì)胞特異性產(chǎn)物。Cbfal序列是高度保守的,果蠅、斑馬魚、原雞、小鼠和人的等位基因中編碼區(qū)99%同源,表達(dá)的蛋白只有幾個(gè)氨基酸的差異。因此,其他種屬的Cbfal經(jīng)提純后可應(yīng)用于治療人類骨科疑難病癥如骨缺損、骨不連、骨發(fā)育障礙等。1材
6、料與方法1.1材料實(shí)驗(yàn)所用C57/B16小鼠和SCs的分離鑒定人、大鼠和小鼠的MSCs于骨髓沖洗物,用Percoll密度梯度離心法分離,經(jīng)低血清貼壁培養(yǎng)篩選后,獲得克隆細(xì)胞,體外大量擴(kuò)增后,經(jīng)HE染色、特殊染色、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光、透射電鏡等方法進(jìn)行鑒定。1.2.2真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/Cbfal-Ⅱ的構(gòu)建(1)用Trizol法提取C57胎鼠(E16d)成骨細(xì)胞的總RNA,以帶有HindⅢ和EcoRV酶切位點(diǎn)的引物(上游5′-AAGCTˉTATGGTTAATCT-3′,下游5′-GGCGGCCATATTGATATC-3′)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。(2)將pcDNA3.1(+
7、)質(zhì)粒用HindⅢ和EcoRV酶切后與Cbfal-ⅡcDNA連接,重新轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌,提取純化并行酶切鑒定。(3)重組質(zhì)粒測序,檢測目的片段。2結(jié)果2.1MSCs形態(tài)學(xué)特征原代培養(yǎng)的細(xì)胞接種24~48h后,可見貼壁細(xì)胞,形態(tài)為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞,散在生長,分布不均,少部分呈克隆落狀,也可見單個(gè)細(xì)胞存在。胞體呈長梭形,兩端有長突起,胞質(zhì)內(nèi)顆粒較多,折光性差,核不清楚。經(jīng)過3~5天的生長潛伏期后,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,在第7天時(shí)