eb病毒相關(guān)胃癌及鼻咽癌組織病毒主要潛伏期基因啟動子甲基化狀態(tài)分析

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1、EB病毒相關(guān)胃癌及鼻咽癌組織病毒主要潛伏期基因啟動子甲基化狀態(tài)分析：張霞劉霞荊永正邢曉明王云羅兵【摘要】目的研究分析青島地區(qū)EB病毒(EBV)相關(guān)胃癌及鼻咽癌組織中EBV主要潛伏期編碼基因啟動子甲基化狀態(tài)。方法采用甲基化特異性PCR(MSP)及亞硫酸氫鹽基因組測序法(BGS)，分析32例EBV相關(guān)胃癌及20例EBV陽性鼻咽癌標本中編碼EBV核抗原EBNAs基因的啟動子Cp、P1和LMP2A編碼基因啟動子的甲基化狀態(tài)。結(jié)果EBV相關(guān)胃癌及鼻咽癌腫瘤標本中EBV編碼基因啟動子的甲基化狀態(tài)與腫瘤細胞的潛伏感染類型一致

2、：Cp和P1和LMP2A編碼基因啟動子甲基化狀態(tài)有所不同，兩者在EBV相關(guān)胃癌組織甲基化程度明顯高于其在EBV陽性的鼻咽癌(χ2=19.15、11.01，P<0.01)。結(jié)論甲基化是調(diào)控EBV主要潛伏期基因啟動子活動的重要機制之一?！娟P(guān)鍵詞】皰疹病毒4型,人;胃腫瘤;鼻咽腫瘤;DNA甲基化;啟動區(qū)(遺傳學(xué))[ABSTRACT]ObjectiveTostudyandanalyzethemethylationstatusofmajorEpsteinBarrvirus(EBV)latencypromotersi

3、nEBVassociatedgastriccarcinoma(EBVaGC)andnasopharyngealcarcinoma(NPC)inQingdaoarea.MethodsMethylationstatusofspecificCpGsitesofCp,P1promoter(LMP1p)andLMP2Apromoter(LMP2Ap)aticallydetectedin32EBVaGCsand20NPCsbybisulfitegenomicsequencing(BGS)andmethylationspe

4、cificPCR(MSP).ResultsThemethylationstatusofthesepromotersinEBVaGCethylated,ethylated;ThemethylationstatusofLMP1pandLMP2ApinEBVaGCNPC:themethylationratesofLMP1pandLMp2ApinEBVaGCethylationstatusoftheEBVmajorlatencypromotersisoneofimportantmechanismsinregulating

5、theactivitiesofthesepromoters.　　[KEYP)1、2A和2B，EBV編碼的小RNA(EBER)1和2以及BARF0的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)EBV潛伏期基因表達形式不同分為潛伏Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3種潛伏類型。EBV相關(guān)胃癌和BURKITT淋巴瘤組織均可以檢測到潛伏期基因EBNA1、EBERs、LMP2A、BARF0的轉(zhuǎn)錄表達，為潛伏Ⅰ型。除了上述基因以外，在鼻咽癌組織、HODGKIN病中還可檢測到LMP1的表達者為Ⅱ型潛伏。體外EBV永生化的B淋巴母細胞系(LCL)可檢測到包括6種EBNAs和3

6、種LMPs等在內(nèi)的大部分EBV潛伏期基因的表達，稱為Ⅲ型潛伏。研究表明，EBV相關(guān)胃癌及鼻咽癌組織中病毒基因表現(xiàn)為限制性表達，推測EBV可能通過表觀遺傳機制調(diào)控病毒基因啟動子，尤其是通過其甲基化狀態(tài)來調(diào)控病毒基因的表達[3]。研究顯示，EBV編碼基因啟動子序列中CpG位點甲基化可抑制相應(yīng)基因的表達，但這些研究主要集中在淋巴細胞的EBV陽性腫瘤和細胞系。本實驗選擇上皮的EBV相關(guān)胃癌和EBV陽性鼻咽癌作為研究對象，檢測其EBV主要潛伏期基因啟動子甲基化狀態(tài)，為深入探討EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生機制及防治提供實驗基礎(chǔ)?！　?/p>

7、1材料和方法　　1.1細胞系　　EBV陽性Akata、Raji和B958細胞系由日本鳥取大學(xué)醫(yī)學(xué)部生體情報學(xué)教室西連寺剛教授惠贈，分別為潛伏Ⅰ型、潛伏Ⅲ型Burkitt淋巴瘤細胞系，EBV永生化的潛伏Ⅲ型LCL細胞系用作該實驗的對照細胞。上述細胞用含有體積分數(shù)0.10的胎牛血清、105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI1640營養(yǎng)液，于37℃、體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?！　?.2腫瘤標本　　新鮮胃癌組織和石蠟包埋鼻咽癌組織取自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院﹑蓬萊市人民醫(yī)院和煙臺毓璜頂醫(yī)院。采用原位

8、雜交檢測石蠟組織切片中EBV編碼的小分子非多聚腺苷酸EBER1的轉(zhuǎn)錄[4]，篩選出32例EBV陽性胃癌和20例EBV陽性鼻咽癌標本?！　?.3DNA提取　　采用酚氯仿異戊醇抽提法常規(guī)提取新鮮胃癌組織DNA，采用QIAampDNAFFPE試劑盒提取石蠟包埋鼻咽癌組織DNA，具體操作步驟按試劑盒(QIAamptissuekit,Qiagen,Hilden,Germany)