二氫嘧啶酶產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件的研究

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1、二氫嘧啶酶產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件的研究藥物生物技術(shù)1999年第2期第6卷論文作者：李　雋　胡卓逸　蔡　萍單位：中國藥科大學生化研究室，南京210009關(guān)鍵詞：二氫嘧啶酶；惡臭假單胞菌；對羥基苯海因　　摘　要　通過篩選確定由惡臭假單胞(Pseudomonasputida)D菌產(chǎn)生的二氫嘧啶酶對5-對羥基苯海因的水解能力較強，該產(chǎn)酶菌發(fā)酵條件的研究表明酵母膏對產(chǎn)酶十分重要。甲硫乙基海因?qū)Χ溧奏っ妇哂袕娬T導作用。此產(chǎn)酶菌最適培養(yǎng)基組成為(%)：甘油1.0，酵母膏1.0，NaCl0.3，K2HPO4·3H2O0.2，甲硫乙基海因0.1，MgCl2·6H2O0.05，28℃，發(fā)酵18h，每m

2、l發(fā)酵液酶活力為2.26U。ScreeningofStrainsProducingdihydropyrimidinase　　andFermentationConditions　　liJun,HuZhuoyi,CaiPing(DivisionofBiochemistry,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nangjing210009)　　Abstract　DihydropyrimidinaseinintactcellsofPseudomonasputidaDhashighspecificityfor5-(4-hydroxyphenyl)hydantoin.Op

3、timumconditionsforgrowthanddihydropyrimidinaseformationofPseudomonasputidaDweredefined:yeastextractisanessentialfactorforenzymeformation.5-Methylthioethylhydantoinwasfoundtobeastrongeffectiveinduceraswell.Suitablemediumconsistsofyeastextract1.0%,glycerol1.0%,K2HPO4·3H2O0.2%,NaCl，0.3%,5-methlyth

4、ioethylhydantoin.0.1%andMgCl2·6H2O0.05%.Whentheorganismwasgrowthat28℃for18h,about2.26units/mlofdihydropyrimidinasewasotained.　　KeyWords　Dihydropyrimidinase,Pseudomonasputida,5-(4-hydroxyphenyl)hydantoin　　D-氨基酸是制備β-內(nèi)酰胺類抗生素如羥氨芐青霉素，頭孢菌素的重要中間介質(zhì)。同時，它也是合成多肽類激素，多種農(nóng)藥的中間體［1］。最常見制備的方法有3種，其中最經(jīng)濟的方法應(yīng)屬生物酶法即二

5、氫嘧啶酶水解海因類化合物制備法［2］?！　adie等人發(fā)現(xiàn)在動植物組織中存在有降解海因類化合物的酶，此種酶能將海因水解成海因酸［3，4］，以后，Wallach和Grisolic又從牛肝中制得此種酶，因能催化二氫尿嘧啶生成N-氨基甲酰-β-丙氨酸，所以命名為二氫嘧啶酶(Dihydropyrimidinase)［EC3.5.2.2］.他們發(fā)現(xiàn)二氫嘧啶酶不僅能水解打開二氫嘧啶環(huán)，并且還可以水解與二氫嘧啶結(jié)構(gòu)相類似的海因類化合物，所以二氫嘧啶酶又稱海因酶(Hydantoinase)［5，6］?！　”疚膱蟮?-對羥基苯海因不對稱水解生成N-氨基甲酰D-對羥基苯甘氨酸的二氫嘧啶酶的菌種篩選和發(fā)

6、酵條件的研究?！　?　材　料　　1.1　菌種　　共篩選菌種50株，包括10個屬，15個種?！　?.2　斜面培養(yǎng)基　　普通瓊脂培養(yǎng)基　　1.3　篩選培養(yǎng)基組成(%)　　甘油1.0，酵母膏1.0，K2HPO4·3H2O0.2，NaCl0.3，MgCl2·6H2O0.05;用4mol/LNaOH調(diào)pH至7.2～7.4，500ml錐形瓶裝50ml液體培養(yǎng)基，熱壓滅菌30min。　　1.4　試劑　　N-氨基甲酰D-對羥基苯甘氨酸根據(jù)StarkTSmyth［7］制備。海因，甲硫乙基海因，苯海因根據(jù)Suzuki［8］，Henze和Speer法制備［9］，對羥基苯海因根據(jù)乙醛酸法制備［10］。其余試

7、劑均為市售商品?！　?.5　儀器　　JHZ-82恒溫振蕩器；GL20A全自動高速冷凍離心機?！　?　方　法　　2.1　培養(yǎng)方法　　接種菌種于斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h。每支斜面培養(yǎng)基中加入10ml無菌水制成菌懸液，每50ml液體培養(yǎng)基加入1ml菌懸液，于28℃，170r/min發(fā)酵培養(yǎng)18h。取3ml發(fā)酵液5000r/min離心10min，棄上清用生理鹽水洗滌菌體后，5000r/min離心，收集菌體?！　?.2　酶活力測定：　　采用改進的Cecere法”