鼠抗人ctni單克隆抗體fab段基因克隆和序列分析

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1、鼠抗人cTnI單克隆抗體Fab段基因克隆和序列分析公文易文秘資源網(wǎng)　佚名　2008-10-140:33:41　我要投稿　添加到百度搜藏提取的RNA純度很高.H1,H4,H5,H7上游引物與下游引物IgG1擴(kuò)增出800bp左右片段；H3擴(kuò)增出400bp左右片段；H2,H6未見片段擴(kuò)出（圖1）.下游引物IgG2b，IgG3與所有上游引物配對均未見片段擴(kuò)出.測序報(bào)告證實(shí)H1，H4，H5，H7引物擴(kuò)增的重鏈Fd段基因具有同源性.圖2,3為輕鏈PCR擴(kuò)增電泳圖，將擴(kuò)出的所有片段進(jìn)行測序，表明L13引物擴(kuò)增出700bp左右片段為抗體序列片段，其

2、余為非抗體序列片段.　　M：DL2000marker;1～7∶1～7對上游引物擴(kuò)增的重鏈PCR產(chǎn)物.　　圖1重鏈Fd瓊脂糖凝膠電泳（略）　　M：DL2000marker;1～5∶1～5對上游引物擴(kuò)增的重鏈PCR產(chǎn)物.　　圖21～5對上游引物擴(kuò)增的輕鏈PCR產(chǎn)物電泳（略）　　2.2轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌選取H1和L13的PCR產(chǎn)物作連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，可以看到重鏈和輕鏈組分布均勻的藍(lán)白菌落，二者比例約為1∶1，白色菌落均有20余個(gè)，對重鏈、輕鏈分別挑取16個(gè)菌落.　　2．3菌落PCR電泳可見重鏈800bp左右的片段，可見輕鏈700b

3、p左右的片段（圖4，5），證明有目的片段插入T載體中.用小量質(zhì)粒抽提試劑盒將質(zhì)粒抽提出來，送至TaKaRa公司測序.　　2.4重組質(zhì)粒的插入片段測序報(bào)告［7-9］GenBank登錄號(hào)分別為AY484430，AY484431.輕鏈第23位和第93位亦為骨架區(qū)的兩個(gè)半胱氨酸（Cys）.上述獲得的抗體Fab段基因即是雜交瘤細(xì)胞正常表達(dá)的抗人cTnI單抗基因,為IgG1亞型.網(wǎng)上核對VBASE數(shù)據(jù)庫，重鏈可變區(qū)屬于VH3家族，J段來源于JH3a，輕鏈可變區(qū)屬于VKⅡ亞類（SubgroupⅡ），J段來源于JK2.　　M：DL2000mark

4、er；1～8∶6～13對上游引物擴(kuò)增的輕鏈PCR產(chǎn)物.　　圖36～13對上游引物擴(kuò)增的輕鏈PCR產(chǎn)物電泳（略）　　M：DL2000marker;1，6，8，9：未插入重鏈Fd段的PCR產(chǎn)物；2～5，7：插入重鏈Fd段的PCR產(chǎn)物.　　圖4重鏈片段的菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳（略）　　M：DL2000marker;1～4，6～13，15，16：插入輕鏈片段的PCR產(chǎn)物；5，14：未插入輕鏈片段的PCR產(chǎn)物.　　圖5輕鏈片段的菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳（略）　　3討論　　由于本實(shí)驗(yàn)室已有能分泌mAbcTnI的雜交瘤細(xì)胞系，因此，我們首先

5、合成若干對通用引物，用RTPCR技術(shù)，將抗cTnI抗體的Fab段基因擴(kuò)增出來，測序，經(jīng)Internet網(wǎng)(網(wǎng)址：www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)［7］核實(shí)，發(fā)現(xiàn)H1，H5，H73種引物擴(kuò)增出來的重鏈序列具有同源性，為同一序列；在輕鏈基因克隆中，獲得一個(gè)無功能的輕鏈產(chǎn)物，它來自雜交瘤親代細(xì)胞之一骨髓瘤細(xì)胞SP2/0.有關(guān)該骨髓瘤細(xì)胞分泌輕鏈的全序列已見報(bào)道，最突出的特點(diǎn)是其輕鏈基因的第23位氨基酸是酪氨酸（Tyr），而不是真正雜交瘤細(xì)胞所分泌輕鏈的半胱氨酸（Cys）.如L25，L610等上游引物擴(kuò)增出

6、來的cDNA片段，均為這種無功能的輕鏈產(chǎn)物.L1，L11,L12等上游引物擴(kuò)增出來的cDNA片段測序，經(jīng)核實(shí)證明，缺失FR1和CDR1功能區(qū).唯有L13上游引物擴(kuò)增出來的700bp的cDNA片段為有功能的輕鏈基因產(chǎn)物.為得到完整的Fab段基因序列，取H1和L13引物PCR產(chǎn)物做TA克隆.測序結(jié)果用BLAST和DNAman軟件分析，得到氨基酸序列的編碼框，中間都沒有中止密碼.目前國內(nèi)外尚未見抗cTnI抗體基因序列相關(guān)報(bào)道.在本實(shí)驗(yàn)中所得到的重鏈和輕鏈的基因序列已經(jīng)被美國國立醫(yī)學(xué)圖書館的免疫球蛋白數(shù)據(jù)庫收錄，登錄號(hào)分別為AY484430

7、，AY484431.抗人cTnI抗體的Fab段基因的克隆及序列分析為抗人cTnI嵌合抗體的真核蛋白表達(dá)打下基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】　?。?］張寄南，楊國平，蘇恩本,等.血清肌鈣蛋白I診斷急性心肌梗塞的研究［J］，中華心血管病雜志，1997,25(5),379-382.　?。?］張寄南，蘇恩本，魏瑾,等.血清肌鈣蛋白I升高與病毒性心肌炎診斷及病程關(guān)系探討［J］，中華心血管病雜志，1999,27(6),421-424.　?。?］NagehT,SherwoodRA,HarrisBM,etal.CardiactroponinIforriskstr

8、atificationfollowingpercutaneouscoronaryarteryinterventioninacutecoronarysyndromes［J］.CatheterCardiovascInterv,2001,5