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1、共聚焦激光掃描顯微術(shù) 及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用姚忠祥yaozhx@yahoo.com一、概述共聚焦激光掃描顯微術(shù)(ConfocalLaserScanningMicroscopy,CLSM)特點(diǎn)：1.顯微鏡成像2.激光掃描3.計(jì)算機(jī)圖象處理簡(jiǎn)史:馬文.閔斯基(MarvinMinsky)1957（美國(guó)專利）矛盾：成像質(zhì)量、掃描速度狹縫掃描:成像質(zhì)量不佳臺(tái)階掃描:光欄不動(dòng)，移動(dòng)工作臺(tái)標(biāo)本光束掃描：現(xiàn)通用二、基本原理1.光學(xué)成像激光器產(chǎn)生的激光經(jīng)物鏡聚焦到樣品上反射光或熒光經(jīng)目鏡匯聚于探測(cè)器探檢測(cè)器前有一
2、小孔(Pinhole)匯聚光束2.成像保存以電信號(hào)形式儲(chǔ)存，可以進(jìn)行圖象分析（參數(shù)、偽彩、值等）。3.共軛(confocal)是指光源孔和檢測(cè)針孔對(duì)物鏡焦平面是共軛的。寬場(chǎng)照明顯微鏡和共聚焦圖象比較三、CLSM的應(yīng)用展現(xiàn)最清晰圖象細(xì)節(jié)圖象處理功能1.光學(xué)切片功能：顯微CT微動(dòng)進(jìn)步馬達(dá)最小步距0.1um2.三維圖象重建：3D軟件X，Y，Z軸重建，立體旋轉(zhuǎn)3.熒光物質(zhì)的定位，定量與動(dòng)態(tài)測(cè)量（單標(biāo)、雙標(biāo)、多重標(biāo)記）高速采集Dronpa蛋白FRAP光漂白Folu-EGFP-EB3TubulinActin
3、線粒體4.細(xì)胞內(nèi)PH及Ca,Na等離子定位、雙標(biāo)記組合、OD值與免疫細(xì)胞組化、原位雜交技術(shù)相結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)功能1.粘附細(xì)胞的分選：物理化學(xué)特性，細(xì)胞亞群2.激光細(xì)胞顯微外科及光陷阱(opticaltrap)技術(shù)：激光刀：細(xì)胞穿孔、灼燒細(xì)胞器、切割染色體、切除神經(jīng)細(xì)胞突起光陷阱：利用激光的增強(qiáng)效應(yīng)，鉗制或移動(dòng)細(xì)胞器、染色體，進(jìn)行細(xì)胞融合、改建、神經(jīng)絲去除3.熒光漂白恢復(fù)技術(shù)(FluorescentRedistributionAfterPhotobleaching,FRAP)高濃度脈沖使細(xì)胞某一區(qū)域
4、熒光淬滅，記錄周圍非淬滅熒光分子擴(kuò)散至淬滅區(qū)的時(shí)間，了解細(xì)胞連接的多少、細(xì)胞骨架的組裝等熒光標(biāo)記物：CFDAam細(xì)胞間通訊連接的影響因素：PH,Ca2+,cAMP等FRAP熒光粹滅漂白恢復(fù)法舉例熒光染料：二乙基羧化熒光素(carboxyfluoresceindiacetate，CFDA)標(biāo)本：大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞（細(xì)胞培養(yǎng)）分組：實(shí)驗(yàn)組，可見(jiàn)熒光恢復(fù)現(xiàn)象干預(yù)組（加GJ阻斷劑），無(wú)熒光恢復(fù)現(xiàn)象觀察時(shí)間：光漂白后0，2，4分鐘ABCDABCD4、膜流動(dòng)性的測(cè)定細(xì)胞膜熒光探針受到極化光的刺激激化后，發(fā)射
5、光的極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，而這種有序的運(yùn)動(dòng)自由度依賴于熒光分子周圍膜流動(dòng)性，故極性測(cè)量可以反映膜的流動(dòng)性5.光活化技術(shù)或稱光籠鎖（caged）化合物技術(shù)籠鎖化合物又稱光致不穩(wěn)定籠鎖化合物(Photolabilecagedcompounds)，通過(guò)基團(tuán)修飾以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前體形式存在。通常是可逆的。原理：紫外線照射→共價(jià)鍵斷裂→釋放生物活性分子籠鎖化合物的兩種光化學(xué)反應(yīng)原理：偶氮苯的光致同分異構(gòu)作用和硝基甲苯的光致分解作用1.偶氮苯衍生物：偶氮苯衍生物具有順式和反式立體同分異構(gòu)體
6、，其藥理性質(zhì)不同，并可用不同波長(zhǎng)光照以控制兩種同分異構(gòu)體間的轉(zhuǎn)化。早在經(jīng)典的籠鎖化合物問(wèn)世以前，已有乙酰膽堿激動(dòng)劑與偶氮苯結(jié)合生成光敏物質(zhì)Bis-Q。Bis-Q順式無(wú)活性，用420-440nm光照后即轉(zhuǎn)化成反式而激活，再經(jīng)過(guò)340nm光照后又變成順式。Bio-Q與電生理技術(shù)結(jié)合用于研究電鰻和電鰩的乙酰膽堿受體。2.鄰硝基甲苯衍生物：目前應(yīng)用最廣泛的籠鎖化合物系利用硝基甲苯的光敏性質(zhì)合成。當(dāng)生物活性分子與硝基甲苯結(jié)合即暫時(shí)失活，故又將后者稱為掩蔽基團(tuán)或籠鎖基團(tuán)。一旦受到光照，連接于側(cè)鏈碳原子的前體
7、即解離而釋放出活性分子、質(zhì)子和亞硝基副產(chǎn)物?；\鎖神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)及抗體例：光照解籠鎖NPE-氨甲酰膽堿→血管平滑肌收縮（氨甲酰釋放）Caged入Cell途徑：誘入法，酯化法，電極導(dǎo)入法，膜片鉗全細(xì)胞方式導(dǎo)入法CLSM的優(yōu)點(diǎn)1.激光是單色光、LM觀察、熒光觀察2.推進(jìn)器步距達(dá)0.1um（“顯微CT”）3.圖象以電信號(hào)形式記錄、儲(chǔ)存，可修飾偽彩、測(cè)定細(xì)胞參數(shù)，直接獲得圖象4.圖形經(jīng)精細(xì)調(diào)焦的光束成像，清晰度高5.可活體觀察、動(dòng)態(tài)觀察四、CLSM使用步驟（一）樣品準(zhǔn)備培養(yǎng)細(xì)胞，如用鈣Fluo-3可用市售
8、培養(yǎng)皿紫外激發(fā)，F(xiàn)luo-2,0.2um蓋玻片制成培養(yǎng)瓶底活組織切片：甘油封片，無(wú)自發(fā)熒光（二）選擇熒光探針1000余種鈣：Fluo-3/am(水溶性)不用紫外光激發(fā)，可滲透細(xì)胞。Fluo-2用紫外激發(fā)，不穿透，需用Microinjection觀察細(xì)胞內(nèi)PH：Snarf熒光素中插入萘而合成，可與Fluo-3或Fluo-2聯(lián)合測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣與PHCLSM常用熒光探針細(xì)胞內(nèi)鈣：Fluo-3,Rhod-1,Indo-1,Fura-2DNA&RNA:碘化丙錠PI,吖啶橙AO膜電位：DiBAC4PH值：SN
