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1、激光掃描共聚焦顯微鏡LaserScanningConfocalMicroscope(LSCM)杲海霞河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室采用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，采用共軛聚焦原理和裝置，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細(xì)胞水平上觀察生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化，并利用計算機(jī)對所觀察的對象進(jìn)行數(shù)字圖象處理的一套集觀察、分析和輸出為一體系統(tǒng)。它把光學(xué)成像的分辨率提高了30%~40%，成為形態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代的研究工具。LSCM的發(fā)展1957年提出了共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些基本原理，并獲得了美國的專利。1967年成功
2、的應(yīng)用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個光學(xué)橫面。1970年牛津和阿姆斯特丹同時向科學(xué)界推薦了一種新型的掃描共聚焦顯微鏡。1984年Bio-Rad公司推出了世界第一臺共聚焦顯微鏡品。1987年White和Amos在英國《自然》雜志發(fā)表了“共聚焦顯微鏡時代的到來”一文，標(biāo)志著LSCM已成為進(jìn)行科學(xué)研究的重要工具。隨后Zeiss、Leica、Meridian等多家公司相繼開發(fā)出不同型號的共聚焦顯微鏡。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，產(chǎn)品的性能也不斷改進(jìn)和更新，應(yīng)用的范圍也越來越廣泛。HippocampusneuronsexpressingGFPLSCM與普通熒光顯微鏡的圖像質(zhì)量比較熒光顯微鏡LSCMLSCM的
3、重要組件主要系統(tǒng)包括激光光源、自動顯微鏡、掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測器）、數(shù)字信號處理器、計算機(jī)以及圖象輸出設(shè)備（顯示器、彩色打印機(jī)）等。激光器顯微鏡：物鏡載物臺計算機(jī)系統(tǒng)：圖像分析與控制系統(tǒng)激光掃描共聚焦顯微鏡vs熒光顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡熒光顯微鏡激光作為光源的優(yōu)點(diǎn)單色性強(qiáng)譜線寬度可小于10-8nm方向性強(qiáng)發(fā)射角僅為毫弧度數(shù)量級高亮度相干性好基于上述主要特點(diǎn)，激光作為掃描共聚焦顯微鏡的光源是最理想的波長功率（mW）激光器類型325351457-514543.5632.8700-1100115210-30300251.253.520001氦鎘(He-Cd)激光
4、器帶紫外的水冷氬離子激光小型氬離子激光綠氦氖(He-Ne)激光紅氦氖(He-Ne)激光藍(lán)寶石激光氦氖(He-Ne)激光激光掃描共聚焦顯微鏡中常見的激光器激光器顯微鏡LeicaDMIRBE倒置熒光顯微鏡物鏡LSCM物鏡的重要參數(shù)NA數(shù)值孔徑又叫做鏡口率，簡寫為N.A。是物鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷物鏡性能高低的重要標(biāo)志。N.A=n*sina/2n：物體與物鏡間媒質(zhì)的折射率a2：物鏡孔徑角的一半溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.52，水的為1.3，空氣為1。香柏油與玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。N.A.越大：放大倍數(shù)越大，分辨率越高，N.A.越大：視場寬度與工作
5、距離越小MagnificationNumericalApertureWorkingDistance(mm)AchromatCorrection4x0.1030.0010x0.256.1020x0.402.1040x0.650.6560x0.800.30100x(oil)1.250.184x20x10x40x60x100x載物臺計算機(jī)系統(tǒng)圖像分析與控制系統(tǒng)分析軟件控制軟件+激光共聚焦顯微鏡原理圖1.共聚焦顯微鏡簡化原理圖用于激發(fā)熒光的激光束(Laser)透過入射小孔(lightsourcepinhole)被二向色鏡(Dichroicmirror)反射，通過顯微物鏡(Objectivelen
6、s)匯聚后入射于待觀察的標(biāo)本(specimen)內(nèi)部焦點(diǎn)(focalpoint)處。激光照射所產(chǎn)生的熒光(fluorescencelight)和少量反射激光一起，被物鏡重新收集后送往二向色鏡。其中攜帶圖像信息的熒光由于波長比較長，直接通過二向色鏡并透過出射小孔(Detectionpinhole)到達(dá)光電探測器(Detector)（通常是光電倍增管（PMT）或是雪崩光電二極管（APD）），變成電信號后送入計算機(jī)。而由于二向色鏡的分光作用，殘余的激光則被二向色鏡反射，不會被探測到。共軛圖2.探測針孔的作用示意圖（解釋了出射小孔所起到的作用）只有焦平面上的點(diǎn)所發(fā)出的光才能透過出射小孔；焦平面以
7、外的點(diǎn)所發(fā)出的光線在出射小孔平面是離焦的，絕大部分無法通過中心的小孔。因此，焦平面上的觀察目標(biāo)點(diǎn)呈現(xiàn)亮色，而非觀察點(diǎn)則作為背景呈現(xiàn)黑色，反差增加，圖像清晰。在成像過程中，出射小孔的位置始終與顯微物鏡的焦點(diǎn)(focalpoint)是一一對應(yīng)的關(guān)系（共軛conjugate）,因而被稱為共聚焦（con-focal）顯微技術(shù)。LSCM掃描圖像方式單一光學(xué)切片掃描(singleopticalsection,x-y)時程活細(xì)胞掃描(timela
