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1、引物探針設計簡介已有2993次閱讀2009-1-120:48
2、個人分類:課堂集錦
3、系統(tǒng)分類:科研筆記1．寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個擴增反應成功的關鍵。所選的引物序列將決定PCR產物的大小、位置、以及擴增區(qū)域的Tm值這個和擴增物產量有關的重要物理參數。好的引物設計可以避免背景和非特異產物的產生，甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設計也極大的影響擴增產量：若使用設計粗糙的引物，產物將很少甚至沒有；而使用正確設計的引物得到的產物量可接近于反應指數期的產量理論值。當然，即使有了好的引物，依然需要進行反應條件的優(yōu)化，比如調整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑
4、如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。計算機輔助引物設計比人工設計或隨機選取更有效。一些影響PCR反應中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，易于在計算機軟件中被編碼和限定。計算機的高速度可完成對引物位置、長度以及適應用戶特殊條件的其他有關引物的變換可能性的大量計算。通過對成千種組合的檢測，調整各項參數，可提出適合用戶特殊實驗的引物。因此通過計算機軟件選擇的引物的總體“質量”（由用戶在程序參數中設定）保證優(yōu)于通過人工導出的引物。需要指出的是，引物不必與模板完全同源，因此可包含啟動子序列、限制酶識別位點或5'端的各種修飾，這種對引物的修飾不會妨礙PCR反應，而會在以后使用
5、擴增子時發(fā)揮作用。2．基本PCR引物設計參數引物設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。特異性是指發(fā)生錯誤引發(fā)的頻率。特異性不好或劣等的引物會產生額外無關和不想要的PCR擴增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見到；引物效率是指在每一PCR循環(huán)中一對引物擴增的產物與理論上成倍增長量的接近程度。①引物長度；特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內，18到24個堿基的寡核苷酸鏈是有很好的序列特異性的。引物越長，擴增退火時被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應，使用確保溶解溫度不低于54℃的最
6、短的引物，可獲得最好的效率和特異性?？偟膩碚f，最好在特異性允許的范圍內尋求安全性。每增加一個核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數應用的最短引物長度為18個核苷酸。引物設計時使合成的寡核苷酸鏈（18～24聚物）適用于多種實驗條件仍不失為明智之舉。②引物的二級結構包括引物自身二聚體、發(fā)卡結構、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結合從而影響引物效率。對于引物的3'末端形成的二聚體，應控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三個連續(xù)的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩(wěn)定結構的可能性，引物中間或5'端的要求可適當放寬。引物自身形成的發(fā)卡結構，也以3'
7、端或近3'端對引物-模板結合影響更大；影響發(fā)卡結構的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環(huán)結構形式亦有很大的關系。應盡量避免3'末端有發(fā)卡結構的引物。③引物GC含量和Tm值PCR引物應該保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20個堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56～62℃范圍內，這可為有效退火提供足夠熱度。一對引物的GC含量和Tm值應該協(xié)調。協(xié)調性差的引物對的效率和特異性都較差，因為降低了Tm值導致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高，其錯誤引發(fā)的機率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm值低的引物對可能完全不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內已合成好的寡核苷酸中
8、選擇一對新的引物時，這種GC含量和Tm值的協(xié)調非常關鍵。一般來說，一對引物的Tm值相差盡量不超過2～3攝氏度，同時引物和產物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內較好。(條帶淺的調整:1.明確所擴基因的特性:用來研究什么.預期的表達怎么樣.文獻中如何報道.說不定它就是一個低表達乃至表達降低的基因.2.模板量如何確定很重要:模板的上樣量是否很低?有沒有做內參如ACTB或者TUBLIN做下對照看看他們表達怎么樣.是不是也是很低,若太低或擴不出來說明你的體系有問題.上樣量也許可以調整一下.3.Tm的調整:設計引物的時候軟件會給出一個TM;公司合成回來的單子上還會有個TM.一般
9、這兩個TM是不一樣的.我們一般都先按公司給的溫度來擴.調整TM的最大目的不是看產物量如何,而是看產物特異性.如果TM值過低了,就可能有非特異條帶出現,這個時候要適當提高TM值來除掉非特異闊增雜帶.這個是調整TM值的主要目的我覺得.4.用內參調整好模板量后,先做一個溫度梯度PCR:如50-56度先做7個樣來最終確定你的最適宜TM值.之后建議再按這個TM溫度,做一個循環(huán)梯度PCR,做曲線后選擇最適宜的循環(huán)數(有經驗的話也可以根據各條帶亮度肉眼大概確認最佳循環(huán)數).5.小細節(jié)方面的問題:比如可以新鋪一板膠來檢樣而不用舊膠.防止由于E
