淀粉酶活性測定實驗報告

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1、班級：植物092姓名：徐煒佳學(xué)號：0901080223淀粉酶活性的測定一、研究背景及目的酶是高效催化有機體新陳代謝各步反應(yīng)的活性蛋白，幾乎所有的生化反應(yīng)都離不開酶的催化，所以酶在生物體內(nèi)扮演著極其重要的角色，因此對酶的研究有著非常重要的意義。酶的活力是酶的重要參數(shù)，反映的是酶的催化能力，因此測定酶活力是研究酶的基礎(chǔ)。酶活力由酶活力單位表征，通過計算適宜條件下一定時間內(nèi)一定量的酶催化生成產(chǎn)物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷鍵的一類酶的總稱，按照其水解淀粉的作用方式，可分為α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的兩種，存在于禾谷類的

2、種子中。β-淀粉酶存在于休眠的種子中，而α-淀粉酶是在種子萌發(fā)過程中形成的。α-淀粉酶活性是衡量小麥穗發(fā)芽的一個生理指標(biāo),α-淀粉酶活性低的品種抗穗發(fā)芽,反之則易穗發(fā)芽。目前,關(guān)于α-淀粉酶活性的測定方法很多種,活力單位的定義也各不相同,國內(nèi)外測定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝膠擴散法、3?,5-二硝基水楊酸比色法和降落值法?。這3?種方法所用的材料分別是新鮮種子、萌動種子和面粉,獲得的α-淀粉酶活性應(yīng)該分別是延遲(內(nèi)源)α-淀粉酶、萌動種子α-淀粉酶和后熟面粉的α-淀粉酶活性。測定方法優(yōu)點缺點DNS靈敏、準(zhǔn)確、精確度高,適宜精確測量小樣品α-淀粉

3、酶活性大小測定步驟較繁,不便分析大量樣品,測定范圍較窄凝膠擴散法簡便、快速、省時、省力,消耗材料和藥品較少,不需要特殊儀器,測定范圍較寬邊界不清晰,靈敏度與準(zhǔn)確度較低,不適宜精確測量α-淀粉酶活性的大小降落值法快速、省時、重現(xiàn)性好、平行性好、消耗的藥品少,適宜于測量大量樣品消耗的材料多,間接測定α-淀粉酶活性大小本實驗的目的在于掌握α-淀粉酶和β-淀粉酶的提取和測定方法。二、實驗原理萌發(fā)的種子中存在兩種淀粉酶，分別是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下則發(fā)生鈍化。本實驗的設(shè)計利用β-淀粉酶不耐

4、熱的特性，在高溫下（70℃）下處理使得β-淀粉酶鈍化而測定α-淀粉酶的酶活性。酶活性的測定是通過測定一定量的酶在一定時間內(nèi)催化得到的麥芽糖的量來實現(xiàn)的，淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3,5-二硝基水楊酸試劑測定，由于麥芽糖能將后者還原生成硝基氨基水楊酸的顯色基團，將其顏色的深淺與糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含量。常用單位時間內(nèi)生成麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。然后利用同樣的原理測得兩種淀粉酶的總活性。實驗中為了消除非酶促反應(yīng)引起的麥芽糖的生成帶來的誤差，每組實驗都做了相應(yīng)的對照實驗，在最終計算酶的活性時以測量組的值減去對照組的值加以校正

5、。在實驗中要嚴(yán)格控制溫度及時間，以減小誤差。并且在酶的作用過程中，四支測定管及空白管不要混淆。三、材料、試劑與儀器實驗材料：萌發(fā)的小麥種子（芽長1厘米左右）儀器：722光柵分光光度計(編號990695)DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(編號L-304056)離心機(TDL-40B)容量瓶：50ml×1，100ml×1小臺秤研缽具塞刻度試管：15ml×6試管：8支移液器燒杯試劑：①1%淀粉溶液（稱取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸餾水，加熱熔解，冷卻后定容至100ml）；②pH5.6的檸檬緩沖液：A液（稱取檸檬酸20.01克，溶解后定容至1L）B液（稱取檸

6、檬酸鈉29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml混勻即為pH5.5檸檬酸緩沖液；③3，5-二硝基水楊酸溶液（稱取3，5-二硝基水楊酸1.00克，溶于20ml1M氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再加入30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100ml，蓋緊瓶蓋保存）；④麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（稱取0.100克麥芽糖，溶于少量蒸餾水中，小心移入100ml容量瓶中定容）；⑤0.4MNaOH四、實驗步驟1.酶液的制備稱取2克萌發(fā)的小麥種子與研缽中，加少量石英砂，研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，混勻后在室溫下放置，每隔數(shù)分

7、鐘振蕩一次，提取15-20分鐘，于3500轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清液備用。2.α-淀粉酶活性的測定①取4支管，注明2支為對照管，另2支為測定管②于每管中各加酶提取液液1ml，在70℃恒溫水浴中（水浴溫度的變化不應(yīng)超過±0.5℃）準(zhǔn)確加熱15min，在此期間β-淀粉酶鈍化，取出后迅速在冰浴中徹底冷卻。③在試管中各加入1ml檸檬酸緩沖液④向兩支對照管中各加入4ml0.4MNaOH，以鈍化酶的活性⑤將測定管和對照管置于40℃（±0.5℃）恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫15min再向各管分別加入40℃下預(yù)熱的淀粉溶液2ml，搖勻，立即放入40℃水浴中準(zhǔn)確保溫5min

8、后取出，向兩支測定管分別迅速加入4ml0.4MNaOH,以終止酶的活性，然后準(zhǔn)備下步糖的測定。3.兩種淀粉酶總活性的測定取