velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株u266細(xì)胞凋亡研究

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1、Velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡研究作者：陳麗娟，李建勇，錢思軒，朱廣榮，鄭文娟【摘要】　　為了研究velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡效應(yīng)及機(jī)制，采用臺盼藍(lán)拒染法檢測2、10、50和100nmol/Lvelcade處理U266細(xì)胞活率，用流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin-V、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基（ROS），用半定量RT-PCR法檢測bcl-2mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明：velcade抑制U266細(xì)胞增殖；誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡，24小時Annexin-V陽性細(xì)胞比例增高，△ψM降低；12小時時活性氧明顯

2、增高，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；抗凋亡基因bcl-2表達(dá)降低。結(jié)論：velcade對U266細(xì)胞具有增殖抑制和殺傷作用，其可通過內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號通路誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡?！娟P(guān)鍵詞】velcade;多發(fā)性骨髓瘤;細(xì)胞凋亡　　MultipleMyelomaCellLineU266ApoptosisInducedbyVelcade　　AbstractToinvestigatetheeffectofvelcadeonmultiplemyelomacelllineU266apoptosisanditsmechanism，cellviabilityatedbytryp

3、anbluedyeexclusion.Annexin-V，mitochondrialtransmembranepotential(Δψm)andreactiveoxygenspecies(ROS)labeledbyDCFHDAinedbyfloetry，theexpressionofbcl-2mRNAi-quatitativeRT-PCR.Theresultsshoorphologiccharacteristicsofapoptosis.Velcadeat50nmol/LincreasedAnnexinVpositivityandfluoresc

4、enceintensityofDCFbecauseofROSgenerationofU266cells.Expressionofanti-apoptoticgenebcl-2mRNAalsodecreased.Itisconcludedthatvelcadeinhibitethegroultiplemyeloma;apoptosis多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種漿細(xì)胞克隆性增生的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，多發(fā)生于老年人。隨著社會人口的老齡化，其發(fā)病率呈逐漸增高的趨勢。幾十年來對MM一直采用激素和細(xì)胞毒性藥物聯(lián)合治療，盡管近年來加用反應(yīng)停抑制血管新生治療或采用

5、自體骨髓移植治療，但其仍是一種不可治愈的血液系統(tǒng)腫瘤。由此可見，開發(fā)新的治療方法有重要的臨床價值。蛋白酶體抑制劑近年來作為MM新的治療制劑用于臨床試驗(yàn)，本研究就臨床新藥蛋白酶體抑制劑velcade誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞的凋亡作用進(jìn)行探討。　　材料和方法　　細(xì)胞培養(yǎng)　　U266細(xì)胞置于含10%的熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco公司產(chǎn)品）中，于37℃、5%CO2和95%空氣濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞以（2-5）×105細(xì)胞/毫升的密度接種培養(yǎng)，并與不同濃度velcade一起進(jìn)行孵育，對照加DMSO。細(xì)胞活率由臺

6、盼藍(lán)拒染法檢測，根據(jù)處理組存活細(xì)胞數(shù)與死細(xì)胞數(shù)的比例來計(jì)算。形態(tài)學(xué)觀察，細(xì)胞用cytospin(Shandon，Runcorn，UK)收集至載玻片，用瑞氏染液染色并置于光學(xué)顯微鏡下觀察。每次試驗(yàn)重復(fù)3次。生長抑制率及細(xì)胞活率按如下公式計(jì)算：生長抑制率＝［(對照組細(xì)胞數(shù)-處理組細(xì)胞數(shù))／對照組細(xì)胞數(shù)］×100%　存活率＝［活細(xì)胞數(shù)／(活細(xì)胞數(shù)＋死細(xì)胞數(shù))］×100%　　Annexin-V、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基（ROS）的流式細(xì)胞儀分析　　Annexin-V分析　　使用FITC標(biāo)記的AnnexinV和PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，根據(jù)Bect

7、onDickinsonBiosciences公司提供的說明書進(jìn)行操作。簡單地說，?。?-2）×105細(xì)胞，經(jīng)PBS漂洗后加100μl結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，加5μlAnnexinV-FITC，10μlPI避光孵育15分鐘后加400μl結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測?！　【€粒體跨膜電位(Δψm)檢測　　取5×105細(xì)胞，用PBS清洗1次，加入10μg/mlRh123（Sigma公司產(chǎn)品）37℃孵育30分鐘，用PBS漂洗1次，加入終濃度10μg/mlPI4℃暗處放置30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測。活性氧測定細(xì)胞內(nèi)活性氧測定方法參照　　結(jié)果　　velcade對

8、U266細(xì)胞增殖抑制和殺傷作用　　研究結(jié)果表明，velcade可以抑制U266細(xì)胞的生長，同時伴有細(xì)胞活率的降低。U266細(xì)胞經(jīng)2、10