熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量(楊丹丹41207106).doc

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1、熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.學(xué)習(xí)熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的分析原理；2.掌握熒光分光光度計(jì)的操作技術(shù)和測定多維葡萄糖粉中維生素B2的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理:1.維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為：維生素B2溶液在430～440nm藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在535nm。維生素B2在pH=6～7的溶液中熒光強(qiáng)度最大，在pH=11的堿性溶液中熒光消失，所以可以用熒光光度法測維生素B2的含量。維生素B2在堿性溶液

2、中經(jīng)光線照射會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多，故測維生素B2的熒光時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。2.熒光分光光度計(jì)(1)常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長的光而產(chǎn)生熒光。在稀溶液中，熒光強(qiáng)度IF與物質(zhì)的濃度c有以下的關(guān)系：當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，熒光強(qiáng)度IF與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系：這是熒光光譜法定量分析的理論依據(jù)。(知識補(bǔ)充如下：

3、)(2)熒光分析儀顯示記錄器常用的熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測器和顯示記錄器構(gòu)成，如下圖所示：激發(fā)光源單色器液槽檢測器三、試劑與儀器:F-7000熒光光度計(jì)5ml吸量管2只，50ml容量瓶7只,100ml容量瓶1只；10.0μg/ml維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液，冰乙酸，多維葡萄糖粉試樣。四、實(shí)驗(yàn)步驟:（一）F-7000熒光光度計(jì)基本操作：1.打開氙燈，再打開主機(jī)，然后打開計(jì)算機(jī)啟動(dòng)工作站并初始化儀器，預(yù)熱30min。2.儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測量項(xiàng)目，設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù)：設(shè)置激發(fā)

4、波長為442nm，發(fā)射波長為522nm，靈敏度＝2，入射縫寬和出射縫寬均為10nm。（二）樣品測定1.標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度的測定??在6個(gè)干凈的50ml容量瓶中，分別吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入2.00ml冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。得到不同濃度的溶液分別是：0.1，0.2，0.3，0.5，0.6ug/ml的維生素B2溶液，從稀到濃測量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。2.未知試樣的測定稱取0.15-0.2g多維葡萄糖粉試樣,用少量水

5、溶解后轉(zhuǎn)50ml容量瓶中，加2.00ml冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測定標(biāo)準(zhǔn)系列時(shí)相同的條件，平行測量其熒光強(qiáng)度3次。3.退出主程序，關(guān)閉計(jì)算機(jī)，先關(guān)主機(jī)，最后關(guān)氙燈。五、數(shù)據(jù)處理:1.用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：2.未知樣品濃度的測定????????????????根據(jù)待測液的熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得其濃度，計(jì)算出試樣中含量。多維葡萄糖粉的質(zhì)量：0.1874克維生素B2百分含量=0.20(ug/ml)/{(0.1874*1000000/50)(ug/ml)}=0.000053

6、=0.0053％六、注意事項(xiàng):1.使用F-7000熒光光度計(jì)時(shí)，要按照儀器使用規(guī)定使用，不可隨意操作；2.使用石英比色皿時(shí)，要注意勿用手直接觸摸比色皿表面，因握住側(cè)棱。七、思考題:1.試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因?答：熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度，可成倍提高熒光強(qiáng)度。同時(shí)，提高儀器靈敏度，也可提高熒光光度法的靈敏度。而對于吸收光度法，無論是提高激發(fā)光強(qiáng)度提高儀器靈敏度還是提高儀器靈敏度，入射光和出射光同時(shí)增大，其靈敏度不變。因此，熒光光度法較吸收光度法靈敏度高。2.維生

7、素B2在pH＝6～7時(shí)熒光最強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)為何在酸性溶液中測定？答：因?yàn)榫S生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射，會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，后者的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多。因此，測量時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且必須在避光條件下進(jìn)行。