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《維甲酸聯(lián)合膽汁酸對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡的影響及初步機(jī)制研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、維甲酸聯(lián)合膽汁酸對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡的影響及初步機(jī)制研究[摘要]目的探討維甲酸聯(lián)合膽汁酸對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡的影響及初步機(jī)制。方法選用不同濃度的維甲酸及脫氧膽酸鈉，分別或聯(lián)合作用于人結(jié)腸腺癌HT-29細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的增殖以及抑制凋亡情況。結(jié)果維甲酸聯(lián)合膽汁酸可以有效抑制HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用（P<0.05）。結(jié)論維甲酸聯(lián)合膽汁酸能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，且抑制凋亡的程度與濃度相關(guān)，能夠?yàn)榻Y(jié)腸癌的治療提供參考。中國(guó)6/vie [關(guān)鍵詞]維甲酸；膽汁酸；結(jié)腸癌；細(xì)胞增殖；抑
2、制凋亡 [中圖分類號(hào)]R735.35[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[]1673-9701（2017）01-0008-03 結(jié)腸癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國(guó)僅次于胃癌和食道癌，居消化道惡性腫瘤的第3位。隨著我國(guó)居民生活質(zhì)量以及飲食結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)腸癌的臨床發(fā)病率越來(lái)越高。腸腔內(nèi)部微環(huán)境的變化同結(jié)腸癌發(fā)病之間的聯(lián)系受到人們的重視，并且研究人員發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生發(fā)展同動(dòng)物脂肪的攝入存在聯(lián)系，推測(cè)原因是高脂飲食會(huì)加大腸腔內(nèi)部的脫氧膽酸，脫氧膽酸作為膽汁酸的一種，能夠通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞DNA的損傷而誘導(dǎo)結(jié)腸癌出現(xiàn)[1]。維甲酸（A
3、TRA）有著廣泛抗腫瘤增殖的活性，能夠降低結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥性，不過(guò)大劑量使用的毒副作用較為明顯，這就需要探索聯(lián)合用藥抑制細(xì)胞增殖的小劑量ATRA。本研究分析ATRA聯(lián)合膽汁酸脫氧膽酸對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖以及凋亡的影響，探討其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。 1資料與方法 1.1一般資料 結(jié)腸癌細(xì)胞株為STT為Promaga公司生產(chǎn)，小牛血清為杭州四季清公司生產(chǎn)，脫氧膽酸為上海華美公司生產(chǎn)，兔抗人COX-2抗體為Neomarkers公司生產(chǎn)，ATRA為sigma公司生產(chǎn)，酶標(biāo)儀型號(hào)為Elx800?！ ?.2方法
4、1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)以及藥物準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)選用胎牛血清培養(yǎng)液，條件設(shè)置方面，溫度37℃，CO25%，濕度100%，培養(yǎng)細(xì)胞1d到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在弱光條件下?lián)Q液后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[2]。使用100mg的ATRA加入乙醇當(dāng)中配成10mmol/L的母液，在-20℃條件下避光儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)所需要的ATRA使用培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，且全部實(shí)驗(yàn)均需要重復(fù)3次進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。HT-29細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI-1640溶液，添加胎牛血清、鏈霉素以及青霉素，37℃條件下傳代培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況[3]。 1.2.2MTT實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT
5、-29細(xì)胞接種到96孔板，每孔10000。細(xì)胞貼壁1d之后按組別添加濃度10、50、100μmol/L的ATRA，每孔20μL，每組共5個(gè)復(fù)孔，持續(xù)培養(yǎng)24h、48h或72h，在反應(yīng)終止前吸去培養(yǎng)液，并加入RPMI-1640培養(yǎng)基，孵箱內(nèi)3h之后棄上清，使用異丙醇100μL溶解結(jié)晶振蕩10min之后應(yīng)用酶標(biāo)儀讀取值[4]?！ ?.2.3細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡HT-29細(xì)胞根據(jù)5×105/mL接種到6空板，每孔3mL，1d之后按組別加入不同濃度的脫氧膽酸，每孔3mL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。作用1d之后收集貼壁以及懸浮的
6、細(xì)胞，根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[5]?！ ?.2.4免疫細(xì)胞染色HT-29細(xì)胞根據(jù)5×105/mL接種到6空板，每孔3mL，在1d之后分別加入不同濃度的脫氧膽酸，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。作用1d之后終止反應(yīng)并吸去培養(yǎng)液。使用冷丙酮進(jìn)行10min固定，PBS反復(fù)進(jìn)行3次沖洗，滴加100μL的兔抗人COX-2抗體，5℃冰箱儲(chǔ)存，第2天使用PBS反復(fù)進(jìn)行3次沖洗，滴加100μL羊抗兔IgG-HRP，并37℃孵育1h，PBS反復(fù)進(jìn)行3次沖洗之后DAB顯色，脫水，透明，使用樹(shù)膠封片[6]?！ ?.3判斷標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)果判定方面
7、，COX-2及caspase-3染色定位到細(xì)胞質(zhì)。PARP-1染色定位到細(xì)胞核，其中陽(yáng)性物質(zhì)為棕黃色或黃色的顆粒。每張玻片選取3個(gè)視野（×400），每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)100個(gè)細(xì)胞，由病理科醫(yī)師使用相關(guān)軟件來(lái)測(cè)定三者的密度值之后取均值[7]?！ ?.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 檢測(cè)數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！ ?結(jié)果 2.1不同濃度/時(shí)間ATRA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制率 不同濃度/時(shí)間的ATRA對(duì)于細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，8μmol/
8、L的ATRA在作用72h之后對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果顯著優(yōu)于24h以及48h（P<0.05），見(jiàn)表1?！ ?.2ATRA聯(lián)合脫氧膽酸對(duì)HT-29細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果表明，10μmol/L的脫氧膽酸聯(lián)合8μmol/L的ATRA作用HT-29細(xì)胞24h，能夠增加HT-29細(xì)胞的凋亡，同時(shí)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并且S期細(xì)胞明顯減少（P<0.05），見(jiàn)表2?！ ?
