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1、密級(jí)：論文編號(hào):中囯農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文口蹄疫乳酸桿菌活載體疫苗的構(gòu)建及其誘導(dǎo)的黏膜免疫效果ProtectionagainstFootandMouthDiseaseVirusinGuineaPigsviaOralAdministrationofRecombinantLactobacillusplantarumExpressingVP1碩士研究生：王淼指導(dǎo)教師：張永光研宄員申請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研宄方向：動(dòng)物疫苗與分子免疫學(xué)培養(yǎng)單位：蘭州獸醫(yī)研宄所研宄生院2015年5月Secrecy:No.Chines
2、eAcademyofAgriculturalSciencesDissertationProtectionagainstFootandMouthDiseaseVirusinGuineaPigsviaOralAdministrationofRecombinantLactobacillusplantarumExpressingVP1M.S.Candidate：WangMiaoSupervisor：ProfessorZhangYongguangMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecia
3、lty:AnimalVaccineandMolecularImmunologyMay2015摘要口蹄疫(Foot-and-MouthDisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus，F(xiàn)MDV)引起的一種烈性、急性家畜傳染病，傳播速度快，影響范圍大，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖程度的提高，F(xiàn)MD等傳染性疫病對(duì)家畜養(yǎng)殖業(yè)的危害越來(lái)越嚴(yán)重，防治難度不斷加大，傳統(tǒng)防治措施已突顯其不足，對(duì)新的防控技術(shù)、特別是安全有效的新型疫苗的需求日益迫切。VP1是編碼FMDV-
4、VP1蛋白的免疫原性基因，表達(dá)的蛋白帶有誘導(dǎo)FMD免疫反應(yīng)的關(guān)鍵表位。本研究將FMDVVP1基因克隆并進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒并檢測(cè)其在大腸桿菌和乳酸桿菌中的表達(dá)，最后將重組乳酸桿菌免疫豚鼠檢測(cè)其誘導(dǎo)的黏膜免疫保護(hù)效果。具體研究方法和結(jié)果如下：1.FMDVVP1基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組乳酸桿菌的制備從A型FMDV中克隆出VP1基因后，根據(jù)乳酸桿菌密碼子偏好性對(duì)VP1進(jìn)行優(yōu)化，與大腸桿菌-乳酸桿菌穿梭表達(dá)載體pSIP411進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α中篩選出陽(yáng)性克隆菌，重組質(zhì)粒酶切和PCR鑒定成功后再
5、轉(zhuǎn)化到BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和westernblot檢測(cè)可見在24kDa處有明顯的條帶，證明VP1-pSIP411大腸桿菌-乳酸桿菌穿梭重組表達(dá)載體構(gòu)建成功并且在BL21中得到表達(dá)的蛋白具有反應(yīng)原性。然后將重組質(zhì)粒pSIP411-VP1電轉(zhuǎn)化到乳酸桿菌NC8和WCFS1中，通過(guò)質(zhì)粒提取、雙酶切鑒定和PCR鑒定等方法篩選出的陽(yáng)性菌進(jìn)行SppIP誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)westernblot檢測(cè)可見明顯的目的條帶，證明VP1在NC8和WCFS1中得到表達(dá)并且具有反應(yīng)原性。2.重組乳酸桿菌免疫豚鼠
6、以及免疫效果的檢測(cè)動(dòng)物免疫試驗(yàn)中將豚鼠分為5組（pSIP411-VP1-NC8，pSIP411-NC8，pSIP411-VP1-WCFS1，pSIP411-WCFS1和陰性對(duì)照組），免疫期間采集豚鼠唾液、糞便和血清樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞表達(dá)水平，CFSE法測(cè)定脾臟淋巴細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞中和試驗(yàn)檢測(cè)中和抗體含量。結(jié)果顯示，兩組重組乳酸桿菌免疫組抗體水平明顯高于其他三組，差異顯著，CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞含量明顯增多，脾淋巴細(xì)胞在抗原刺激后增殖明顯，可在血清中檢測(cè)到
7、中和抗體。以上結(jié)果表明，VP1在重組乳酸桿菌NC8和WCFS1中獲得了表達(dá)，并且免疫動(dòng)物后增強(qiáng)了動(dòng)物的免疫功能，抵抗了FMDV的感染，為研制預(yù)防FMDV的重組乳酸桿菌疫苗奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：口蹄疫病毒，乳酸桿菌，VP1，黏膜免疫，豚鼠IAbstractMucosalvaccinationisaneffectivestrategyforgeneratingantigen-specificimmuneresponsesagainstmucosalinfectionsoffootandmouthdiseaseviru
8、s(FMDV).Inthisstudy,tworecombinantL.plantarumstrains—NC8andWCFS1—wereconstructedtoexpressasyntheticVP1geneofFMDVAvirus.Wesoughttoevaluatetheimmunologicalandclinicalimpactoftheplasm
