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《口蹄疫乳酸桿菌活載體疫苗的構建及其誘導的黏膜免疫效果》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、密級：論文編號:中囯農(nóng)業(yè)科學院學位論文口蹄疫乳酸桿菌活載體疫苗的構建及其誘導的黏膜免疫效果ProtectionagainstFootandMouthDiseaseVirusinGuineaPigsviaOralAdministrationofRecombinantLactobacillusplantarumExpressingVP1碩士研究生：王淼指導教師：張永光研宄員申請學位類別：農(nóng)學碩士專業(yè)：預防獸醫(yī)學研宄方向：動物疫苗與分子免疫學培養(yǎng)單位：蘭州獸醫(yī)研宄所研宄生院2015年5月Secrecy:No.Chines
2、eAcademyofAgriculturalSciencesDissertationProtectionagainstFootandMouthDiseaseVirusinGuineaPigsviaOralAdministrationofRecombinantLactobacillusplantarumExpressingVP1M.S.Candidate：WangMiaoSupervisor：ProfessorZhangYongguangMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecia
3、lty:AnimalVaccineandMolecularImmunologyMay2015摘要口蹄疫(Foot-and-MouthDisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus，F(xiàn)MDV)引起的一種烈性、急性家畜傳染病，傳播速度快，影響范圍大，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖程度的提高，F(xiàn)MD等傳染性疫病對家畜養(yǎng)殖業(yè)的危害越來越嚴重，防治難度不斷加大，傳統(tǒng)防治措施已突顯其不足，對新的防控技術、特別是安全有效的新型疫苗的需求日益迫切。VP1是編碼FMDV-
4、VP1蛋白的免疫原性基因，表達的蛋白帶有誘導FMD免疫反應的關鍵表位。本研究將FMDVVP1基因克隆并進行優(yōu)化，構建重組表達質(zhì)粒并檢測其在大腸桿菌和乳酸桿菌中的表達，最后將重組乳酸桿菌免疫豚鼠檢測其誘導的黏膜免疫保護效果。具體研究方法和結(jié)果如下：1.FMDVVP1基因的原核表達載體的構建及重組乳酸桿菌的制備從A型FMDV中克隆出VP1基因后，根據(jù)乳酸桿菌密碼子偏好性對VP1進行優(yōu)化，與大腸桿菌-乳酸桿菌穿梭表達載體pSIP411進行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α中篩選出陽性克隆菌，重組質(zhì)粒酶切和PCR鑒定成功后再
5、轉(zhuǎn)化到BL21中進行誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和westernblot檢測可見在24kDa處有明顯的條帶，證明VP1-pSIP411大腸桿菌-乳酸桿菌穿梭重組表達載體構建成功并且在BL21中得到表達的蛋白具有反應原性。然后將重組質(zhì)粒pSIP411-VP1電轉(zhuǎn)化到乳酸桿菌NC8和WCFS1中，通過質(zhì)粒提取、雙酶切鑒定和PCR鑒定等方法篩選出的陽性菌進行SppIP誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)westernblot檢測可見明顯的目的條帶，證明VP1在NC8和WCFS1中得到表達并且具有反應原性。2.重組乳酸桿菌免疫豚鼠
6、以及免疫效果的檢測動物免疫試驗中將豚鼠分為5組（pSIP411-VP1-NC8，pSIP411-NC8，pSIP411-VP1-WCFS1，pSIP411-WCFS1和陰性對照組），免疫期間采集豚鼠唾液、糞便和血清樣品進行ELISA檢測，用流式細胞儀檢測外周血中CD4+、CD8+淋巴細胞表達水平，CFSE法測定脾臟淋巴細胞增殖情況，細胞中和試驗檢測中和抗體含量。結(jié)果顯示，兩組重組乳酸桿菌免疫組抗體水平明顯高于其他三組，差異顯著，CD4+、CD8+淋巴細胞含量明顯增多，脾淋巴細胞在抗原刺激后增殖明顯，可在血清中檢測到
7、中和抗體。以上結(jié)果表明，VP1在重組乳酸桿菌NC8和WCFS1中獲得了表達，并且免疫動物后增強了動物的免疫功能，抵抗了FMDV的感染，為研制預防FMDV的重組乳酸桿菌疫苗奠定了實驗基礎。關鍵詞：口蹄疫病毒，乳酸桿菌，VP1，黏膜免疫，豚鼠IAbstractMucosalvaccinationisaneffectivestrategyforgeneratingantigen-specificimmuneresponsesagainstmucosalinfectionsoffootandmouthdiseaseviru
8、s(FMDV).Inthisstudy,tworecombinantL.plantarumstrains—NC8andWCFS1—wereconstructedtoexpressasyntheticVP1geneofFMDVAvirus.Wesoughttoevaluatetheimmunologicalandclinicalimpactoftheplasm
