[基礎醫(yī)學]核酸疫苗及免疫研究進展

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1、核酸疫苗LOGODiagram4核酸疫苗定義1235核酸疫苗的發(fā)展史核酸疫苗的作用原理核酸疫苗的構建核酸疫苗的優(yōu)缺點和應用現(xiàn)狀疫苗是將病原微生物（如細菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預防傳染病的自動免疫制劑。人們將多種滅活或減毒疫苗稱為第一代疫苗。將用基因工程的方法研制的亞單位疫苗稱為第二代疫苗。理想疫苗應具備的特征有：安全、廉價、熱穩(wěn)定性好，含有多種具有保護作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前前兩代均不能滿足上述標準。故基因疫苗應運而生?；蛞呙绫环Q為第三代疫苗。1990年wolff等從事于基因治療工作時，用外源性重組質(zhì)粒給小鼠肌肉

2、注射后，質(zhì)粒被攝取并能在體內(nèi)至少兩個月穩(wěn)定地表達所編碼蛋白。1991年Williams等發(fā)現(xiàn)外源基因輸入體內(nèi)的表達產(chǎn)物可誘導產(chǎn)生免疫應答。1992年Tang等將表達人生長激素的基因質(zhì)粒DNA導入小鼠皮內(nèi)，小鼠產(chǎn)生特異性抗體，從而提出了基因免疫的概念。1993年Ulmer等將注射技術用于研究流感核酸疫苗，證實核酸注射不但能在體內(nèi)表達抗原蛋白，還可以誘導具有顯著保護作用的免疫應答。因此，1994年在日內(nèi)瓦召開的專題會議上將這種疫苗定名為核酸疫苗。關于核酸免疫的國際會議1994年5月17-18日，瑞士日內(nèi)瓦。WHO主辦。主題：核酸疫苗。1995年2月16-17日，美國馬里蘭州，Bethesda（NI

3、H）。主題：基因疫苗和核酸疫苗戰(zhàn)略。1995年4月6-9日，美國弗吉尼亞州。主題：DNA疫苗：疫苗學的新時代。1996年2月5-8日，美國馬里蘭州NIHNatcher會議中心。主題：核酸疫苗預防傳染性疾病和控制核酸疫苗。定義核酸疫苗(nucleicacidvaccine),也稱基因疫苗(geneticvaccine),是指一類將抗原基因重組到表達載體上的重組質(zhì)粒疫苗，經(jīng)肌肉注射或黏膜免疫等方法導入宿主體內(nèi)，通過宿主細胞表達抗原蛋白，誘導宿主細胞產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的。基因疫苗的構建基因疫苗構建的基本途徑基因疫苗的構建一、構建基因疫苗的載體載體是將抗原基因導入到機

4、體細胞的必要工具。1.載體的分類按照載體功能可分為克隆載體和表達載體；按照載體來源可分為質(zhì)粒、噬菌體、黏粒和病毒載體等。2.常用于構建基因疫苗的載體pcDNA3.1、pcDNA3.1-E、pcDNA3.1/Zeo（+/-）、pcDNA4、pcDNA4/HisMAX、pBudCE4、pRc/RSV、pRc/CMV2等多種基因疫苗的構建二、基因疫苗的構建方法1.抗原基因和載體的制備獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構建基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)，從中調(diào)用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉錄合成互補的DNA片段，建立cDNA文庫；（3）利

5、用聚合酶鏈式反應（PCR）特異性地擴增所需要的目的基因片段，等等。（4）化學合成基因疫苗的構建基因表達載體的組成：復制原點+啟動子+目的基因+終止子+標記基因為了保證抗原基因的定向正確插入，只有以正確的方向插入表達載體讀框啟動子下游才能表達抗原基因，故抗原基因兩端應具有不同的酶切位點，在設計時須注意這點。2.抗原基因與載體的連接連接的方式可分為粘性末端連接和平末端連接兩種，其中前者連接效率較高，使用比較多。連接反應時應考慮反應體積、抗原基因與載體的比例、溫度和時間和酶量。粘性末端連接用同一種或兩種限制性內(nèi)切酶酶切DNA連接酶重組質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點平

6、末端連接質(zhì)粒產(chǎn)生平末端的內(nèi)切酶DNA連接酶產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶核酸酶S1目的基因重組質(zhì)粒產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶核酸酶S1本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點！基因疫苗的構建3.重組質(zhì)粒轉化受體菌轉化：將質(zhì)粒或者以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。轉染：將質(zhì)粒或者以它為載體構建的重組子導入真核細胞的過程。感受態(tài)：細菌經(jīng)過CaCl2溶液處理和短暫熱激后，容易攝入外源DNA，這種狀態(tài)稱為感受態(tài)。其原理是細菌處于0℃、低滲CaCl2溶液中時，細胞壁和細胞膜通透性增加。此時轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，經(jīng)短暫的熱激（42℃）處理后，外源基因容易進入細菌

7、細胞內(nèi)。常用的方法為氯化鈣共沉淀法和電穿孔法?；蛞呙绲臉嫿?.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定一般重組質(zhì)粒鑒定主要按照表型篩選、酶切鑒定和測序鑒定的順序進行（1）插入片段鑒定：酶切鑒定；PCR鑒定。（2）插入片段方向性鑒定：可利用聯(lián)合酶切方案進行目的基因的插入方向鑒定。（3）DNA序列測定：末端終止法測序；自動測序儀測序基因疫苗的構建三、重組質(zhì)粒在真核細胞中的表達與檢測1.重組質(zhì)粒導入真核細胞的方法磷酸鈣共