含氫培養(yǎng)液對(duì)脂多糖LPS致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

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1、分類號(hào)：R-614密級(jí)：學(xué)位類別：科學(xué)學(xué)位團(tuán)專業(yè)學(xué)位口◎?qū)W校代碼：1062學(xué)號(hào)：2010602283又肄眚科鼻號(hào)了材婚“l(fā)H藕纛爨l(xiāng)薯豁滋鞠麓l鼴囂黝1臀’、碩士學(xué)位論文№～STER’SDISSERTATION論文題目：含氫培養(yǎng)液對(duì)脂多糖(LPS)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用TITLEProtectiveeffectsofhydrogen-richmediumonLPS—inducedinjuryinhumanumbilicalveinendothelialcells一級(jí)學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科：麻醉學(xué)論文作者：韓煥芝指導(dǎo)教師：于泳浩教授導(dǎo)師組成員

2、：謝克亮天津醫(yī)科大學(xué)研究生二。一三年五月學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容和致謝的地方外，論文中不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：熟繾L日期：Z口J；年j一用窮日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解天津醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、

3、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文，并編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)。保密口，在——年解密后適用本授權(quán)書(shū)。本論文屬于不保密團(tuán)。(請(qǐng)?jiān)谙鄬?duì)應(yīng)的方框內(nèi)打“√”)學(xué)位論文作者導(dǎo)師簽?zāi)旰骷幽闖7月場(chǎng)日天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要目的：膿毒癥是一種由感染因素誘發(fā)的、以炎癥反應(yīng)為主的綜合癥，嚴(yán)重時(shí)伴有臟器功能障礙，是非心臟重癥監(jiān)護(hù)室住院病人的最常見(jiàn)死因，尚無(wú)有效的治療措施。膿毒癥時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞被過(guò)度、持續(xù)、廣泛激活，其作為炎癥反應(yīng)的靶細(xì)胞及效應(yīng)細(xì)胞，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)持續(xù)的同時(shí)，其自身嚴(yán)重?fù)p傷，最終導(dǎo)致器官穩(wěn)態(tài)破壞，甚至功能衰竭。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞作為膿毒

4、癥治療的靶點(diǎn)具有重要意義。氫氣具有抗氧化、抗炎、抗凋亡及信號(hào)調(diào)節(jié)作用，可治療多種疾病，如缺血再灌注引起的腦、心、肝、肺、腎損傷，神經(jīng)退行性疾病，糖尿病等。前期研究發(fā)現(xiàn)氫氣吸入對(duì)膿毒癥小鼠具有明顯的保護(hù)作用，其具體機(jī)制尚不清楚。本文擬在前期研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，探討含氫培養(yǎng)液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用以及相關(guān)機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。方法：離體培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC．12，以lXl04／mL接種于96孔培養(yǎng)板或以l×106／mL接種于6孔培養(yǎng)板，200gL／孑L或3mL／孑l,。第一部分：分別以濃度為0

5、gg／mL、0．25gg／mL、O．50gg／mL、1．0gg／mL、2．0gg／mL及4．0gg／mL的LPS刺激細(xì)胞，孵育24h后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇適宜的LPS刺激濃度，建立細(xì)胞損傷模型。分別以濃度為0．15mmol／L、O．3mmol／L及0．6mmol／L的含氫培養(yǎng)液處理細(xì)胞，測(cè)定24h后細(xì)胞活性及LDH釋放率，根據(jù)結(jié)果選擇最佳含氫培養(yǎng)液濃度。第二部分：根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本部分實(shí)驗(yàn)選擇LPS刺激濃度為1pg／mL，含氫培養(yǎng)液濃度為0．6mmol／L(飽和氫培養(yǎng)液)。細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組(C組)、氫氣組

6、(H2組)、LPS組和LPS+H2組。C組和LPS組用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；H2組和LPS+H2組用飽和氫培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)LPS組和LPS+H2組加入1gg／mLLPS，而C組和H2組加入等容量的生理鹽水。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定孵育24h后細(xì)胞凋亡及ICAM．1及VCAM．1表達(dá)情況；應(yīng)用相應(yīng)試劑盒測(cè)定孵育3h、6h、12h和24h后細(xì)胞上清液中MDA水平。第三部分：實(shí)驗(yàn)分組同第二部分。應(yīng)用相應(yīng)試劑盒分別測(cè)定孵育3h、6h、12h和24h后細(xì)胞上清液中SOD、CAT活性；分別應(yīng)用免疫熒光及WestemBlot技術(shù)檢測(cè)孵育24h后Nrf2核移位及蛋白表達(dá)水平。結(jié)

7、果：第一部分：MTT結(jié)果顯示：1gg／mL濃度LPS作用24h即可引起血天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，與正常細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。細(xì)胞被LPS干預(yù)后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，LPS濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率成正比，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)選擇LPS的刺激濃度為llag／mL。含氫培養(yǎng)液對(duì)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞增值活性及LDH釋放無(wú)明顯影響(P>O．05)，可以顯著改善LPS所致血管內(nèi)皮細(xì)胞活性降低及LDH釋放，且呈濃度依賴性(P

8、皮細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡顯著增加，其凋亡細(xì)胞率、細(xì)胞表面ICAM．1及VCAM．1表達(dá)較C組和H2組明顯升高