《淀粉酶活力的測(cè)定》PPT課件

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1、實(shí)驗(yàn)七　淀粉酶活力的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諟y(cè)定淀粉酶活力的原理和基本方法二、實(shí)驗(yàn)原理酶是一種具有高度專一性的催化劑。其催化能力的大小用酶的活力來表示。酶活力也稱酶活性，是以酶在最適溫度、最適pH等條件下，催化一定的化學(xué)反應(yīng)的初速度來表示。本實(shí)驗(yàn)是以一定量的α-淀粉酶液，于37℃、pH6.8的條件下，在一定的初始作用時(shí)間內(nèi)將淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖，然后通過與DNS試劑作用，比色測(cè)定求得還原糖的生成量，從而計(jì)算出酶反應(yīng)的初速度，即酶的活力這里規(guī)定，一個(gè)淀粉酶活力單位為在37℃、pH6.8的條件下，每分鐘水解淀粉生成1mg還原糖所需要的酶量

2、。1U=1mg還原糖/min·mL酶三.實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備1、材料淀粉酶液（粗酶液、鹽析液、脫鹽液）2、儀器分光光度計(jì)??恒溫水浴??沸水浴3、器材刻度試管：25mL×17移?液?管：1mL×3（取稀釋后的酶液）燒????杯：250mL×1滴????管：2洗?耳?球：2洗瓶、試管架、移液管架、玻棒：各1移液器：專取NaOH注射器：專取蛋白樣品四、試劑的配制1、淀粉溶液（0.5%）稱取5g可溶性淀粉，溶于1000mL熱水中。2、3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）3、磷酸緩沖液（0.1mol/L，pH6.8），含0.3%NaCl4

3、、NaOH溶液（2.5mol/L）五.操作步驟1、淀粉酶的制備（1）取硫酸銨沉淀法純化蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中獲得的粗酶提取液解凍，取上清液0.05mL，加蒸餾水稀釋到25mL，搖勻備用（2）取硫酸銨沉淀法純化蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中獲得的鹽析蛋白質(zhì)解凍，取上清液0.05mL，加蒸餾水稀釋到25mL，搖勻備用（3）取葡聚糖凝膠層析脫鹽獲得的蛋白液解凍，取0.05mL，稀釋。收集1管的同學(xué)，將0.05mL稀釋到15mL收集2管的同學(xué)，將0.05mL稀釋到10mL試管排列順序空白F1B3B2F3?F2?F1?B3?B2?B1F3F21淀粉32B1?粗酶液

4、鹽析脫鹽0時(shí)刻5min時(shí)刻裝約20mL淀粉溶液，標(biāo)記，轉(zhuǎn)至37℃水浴鍋中因淀粉中含有少量還原糖，某些溶液有色素、雜質(zhì)，需查看酶不水解淀粉的情況37℃室溫實(shí)驗(yàn)編號(hào)操作0號(hào)管粗酶液(1)鹽析液(2)脫鹽液(3)0時(shí)刻5min時(shí)刻0時(shí)刻5min時(shí)刻0時(shí)刻5min時(shí)刻B1B1’F1F1’B2B2’F2F2’B3B3’F3F3’淀粉酶液(ml)0.30.20.5H2O(ml)3.5pH6.8緩沖液各1ml0.3％NaCl各1ml預(yù)熱搖勻，37℃水浴2minNaOH(ml)111111預(yù)熱的淀粉各1ml，迅速搖勻酶促反應(yīng)37℃水浴5min

5、(準(zhǔn)確計(jì)時(shí))NaOH(ml)111111DNS試劑各2ml，搖勻顯色反應(yīng)沸水浴5min，冷卻，各用水定容至25ml，搖勻比色以0號(hào)管為空白參比，測(cè)定λ=540nm處的吸光值記錄A540六.結(jié)果處理1、分別計(jì)算0時(shí)刻、5min時(shí)刻的A540nm平均值。2、根據(jù)圖表中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并利用實(shí)驗(yàn)“3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定糖的含量”中制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算淀粉酶的活力。需要詳細(xì)過程。5min時(shí)刻吸光值0min時(shí)刻吸光值5min時(shí)刻還原糖mg數(shù)0min時(shí)刻還原糖mg數(shù)二者相減，計(jì)算酶活力。1U=1mg還原糖/min·mL酶*稀釋倍數(shù)七.

6、思考題1、在測(cè)定酶活力時(shí)應(yīng)注意哪些反應(yīng)條件？為什么？2、本實(shí)驗(yàn)中兩次加入NaOH溶液的意義是什么?八、分析1.三種酶活力大小順序是怎樣，為什么是這樣？2.酶液的稀釋倍數(shù)是否要改變。3.計(jì)算酶液的總活力、回收率。