引物探針設(shè)計培訓(xùn)資料全

《引物探針設(shè)計培訓(xùn)資料全》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、Taqman法熒光PCR引物探針設(shè)計與目標(biāo)序列互補(bǔ)實時熒光定量PCRTaqMan法TaqMan---水解型雜交探針5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan法工作原理每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光TaqMan法PCR反應(yīng)的建立1、引物、探針的設(shè)計：探針Tm為68-70℃，20－30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400bp

2、，引物Tm為58-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72℃，45S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同總體原則查閱參考文獻(xiàn)，以選取待檢病原體的靶基因。目的基因序列大量查找，利用DNAstar等軟件完成目的DNA或者RNA比對，確定種內(nèi)高保守，種間高特異的區(qū)域為設(shè)計引物探針的靶序列先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近探針。所選序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增

3、片段——這是因為二級結(jié)構(gòu)會影響反應(yīng)效率，而且還會阻礙酶的擴(kuò)增。建議先進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)檢測，如果不能避免二級結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度。擴(kuò)增長度應(yīng)不超過400bp，理想的最好能在100-150bp內(nèi)，擴(kuò)增片段越短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片段也容易保證分析的一致性。保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低，以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號。為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）將引物和探針互相進(jìn)行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。探針設(shè)計原則探針位置盡可能地靠近上游引物探針長度應(yīng)在15

4、-45bp（最好是20-30bp)，以保證結(jié)合特異性檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探針的5’端應(yīng)避免使用G鳥嘌呤——因為5‘G會有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用。整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量——G含量高會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針。為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。引物設(shè)計原則序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)

5、狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之間的TM相差避免超過2℃引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子。Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp－150bp引物末端（最后5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。TaqMan

6、法優(yōu)缺點對目標(biāo)序列的高特異性-----陰性結(jié)果確定設(shè)計相對簡單------與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu)點只適合一個特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價格較高不易找到本底低的探針缺點TMA檢測技術(shù)示意圖TMA擴(kuò)增反應(yīng)原理圖技術(shù)原理同一溫度下，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸（RNA）的一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個（100～1000個）RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個擴(kuò)增循環(huán)；同時，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，實時反映擴(kuò)增循環(huán)情況。分子信標(biāo)探針結(jié)構(gòu)自由能控制在3~5之間

7、Non-T7引物CTATGCATTGCTGAGATTGGAACTTT7引物TAATACGACTCACTATAGGGAGAacctatcctatttgtacatccattcaTMA檢測技術(shù)的優(yōu)勢→領(lǐng)先的RNA檢測技術(shù)TMA技術(shù)檢測病原體RNA。一個病原體細(xì)胞內(nèi)含有多達(dá)個RNA拷貝，大大提高了檢測靈敏度?！冗M(jìn)的恒溫擴(kuò)增技術(shù)核酸擴(kuò)增在一個溫度下進(jìn)行（42℃），不需要熱循環(huán)。→更高的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性TMA技術(shù)的擴(kuò)增效率極高，