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《牛白血病前病毒Taqman熒光PCR檢測(cè)方法的建立-論文.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、·12·《上海畜牧獸醫(yī)通訊》2014年第1期牛白血病前病毒Taqman熒光PCR檢測(cè)方法的建立李凱航鞠厚斌楊顯超寧昆王建(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心上海201103)【摘要】設(shè)計(jì)并合成熒光引物，建立了Taqman熒光PCR體系，可快速檢測(cè)全血樣品中的牛白血病前病毒DNA。所建立的熒光PCR體系可特異檢測(cè)牛白血病病毒核酸，而對(duì)牛病毒性腹瀉一粘膜病毒(BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)以及羊胎腎細(xì)胞(FLK)、牛布魯氏菌擴(kuò)增均呈陰性反應(yīng)，對(duì)pBST—pol重組質(zhì)粒的檢測(cè)敏感性可達(dá)0．32拷貝。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)介于0．67～1．16之間，穩(wěn)定性實(shí)
2、驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)為3．14。采用建立的Taqman熒光PCR體系和OIE推薦的套式PCR對(duì)94份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，兩者定性符合率達(dá)到97．87。關(guān)鍵詞：牛白血病前病毒；Taqman熒光PCR；引物地方流行性牛白血病是由牛白血病病毒1．4陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的構(gòu)建(BLV)引起的牛的一種慢性腫瘤性疾病。其特征BLV的pol基因由PCR擴(kuò)增獲得，通過(guò)TA克為淋巴樣細(xì)胞惡性增生，進(jìn)行性惡病質(zhì)和發(fā)病后的隆得到pBST—pol重組質(zhì)粒并經(jīng)序列證實(shí)，確定為高死亡率。此病在19世紀(jì)末被發(fā)現(xiàn)，但到1969該基因陽(yáng)性質(zhì)粒后，用紫外分光光度計(jì)A26O／A28O年才由美國(guó)的Miller從
3、病牛外周血液淋巴細(xì)胞中吸光值測(cè)定質(zhì)粒濃度，一30℃保存?zhèn)溆?。pBST質(zhì)分離到。目前此病遍及全世界，我國(guó)7O年代在安粒購(gòu)自Novagen公司，膠回收試劑盒購(gòu)自TAKA—徽發(fā)現(xiàn)首例后，繼而在各省市發(fā)生。近年，我國(guó)牛RA。群該病血清陽(yáng)性率已從4％升高至3O1．5熒光PCR反應(yīng)體系的建立～60“。熒光PCR試驗(yàn)在ABI7500熒光PCR儀上進(jìn)目前對(duì)于牛群內(nèi)BLV感染的普查通?；谘?，對(duì)引物濃度、dNTP濃度、探針濃度和熱啟動(dòng)清學(xué)試驗(yàn)如ELISA，可以很好地估計(jì)BLV在牛群Taq酶濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。dNTPs、Taq內(nèi)的流行情況。但樣品僅依靠血清學(xué)檢測(cè)并不酶等
4、均購(gòu)自TAKARA公司，引物和探針由invitro—夠，Martin等報(bào)道同樣一批可疑樣品，間接gen公司合成。ELISA的檢出率為10，而依靠PCR方法的檢出1．6特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)率可達(dá)到17。對(duì)于大量樣品BLV的檢測(cè)，有必將牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病要建立特異性強(qiáng)、靈敏度高的PCR檢測(cè)方法，這有毒、牛布魯氏菌、羊胎腎細(xì)胞(FLK)作為4個(gè)對(duì)照樣利于針對(duì)牛白血病流行病學(xué)感染情況徹底進(jìn)行本提取核酸，各取2作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同調(diào)查。時(shí)設(shè)蒸餾水為陰性對(duì)照組。1材料和方法將計(jì)數(shù)后的pBST—pol質(zhì)粒進(jìn)行1O倍梯度稀1．1病毒與臨床樣品釋，
5、陽(yáng)性質(zhì)粒(3．2×10copies／mL)按1：10～1：牛病毒性腹瀉一粘膜病毒(BVDV，種毒10進(jìn)行相同的3組稀釋，從每個(gè)梯度中各取3p．LAV69)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV，種毒模板進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。AV20)、羊胎腎細(xì)胞(FIK)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察以相同稀釋度的陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板，并以10倍所，牛布魯氏菌樣本為牛布病II型活疫苗，血清學(xué)梯度稀釋成3個(gè)不同梯度的模板(1：10，1：10，陽(yáng)性牛的EDTA抗凝血樣品由本中心采集保存。1：10。)，重復(fù)10次反應(yīng)。1．2核酸提取1．7熒光PCR與套式PCR的比對(duì)樣品的核酸提取采用AXYGEN公司Ax
6、yPrep1．7．1樣本的前處理：無(wú)菌尾根采集上海市1O個(gè)體液病毒DNA／RNA小量試劑盒(CatNo．規(guī)?；膛?chǎng)臨床疑似牛EDTA抗凝血樣本共9451304)，一20℃保存?zhèn)溆?。份?℃冰箱待檢。樣本核酸提取參考AXYGEN1．3引物的設(shè)計(jì)公司AxyPrep體液病毒DNA／RNA小量試劑盒說(shuō)采用AB公司Primer5．0軟件，根據(jù)BLVpol明書。基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物和熒光探針序列如下：1．7．2套式PCR檢測(cè)：參考OIE推薦的套式PCR上游引物C1：5，_AACCCCACCTTCCCATGAC一引物序列合成，PCR結(jié)束后克隆取陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)3’；下游
7、引物C2：5，_TGGTAGGAGGTTAATCT—行序列測(cè)定，最后將采集的94份全血樣品同時(shí)進(jìn)行GATTGTGAGT一3’。FAM-CAGGCCCTTTCTC—熒光PCR方法檢測(cè)，將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。GAGCCCTCTG—TAMRA引物由Invitrogen公司2結(jié)果合成并標(biāo)記熒光基團(tuán)，擴(kuò)增全長(zhǎng)71bp。2．1建立了3OuL熒光PCR反應(yīng)體系：上、下游
