牛白血病前病毒Taqman熒光PCR檢測方法的建立-論文.pdf

《牛白血病前病毒Taqman熒光PCR檢測方法的建立-論文.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、·12·《上海畜牧獸醫(yī)通訊》2014年第1期牛白血病前病毒Taqman熒光PCR檢測方法的建立李凱航鞠厚斌楊顯超寧昆王建(上海市動物疫病預(yù)防控制中心上海201103)【摘要】設(shè)計并合成熒光引物，建立了Taqman熒光PCR體系，可快速檢測全血樣品中的牛白血病前病毒DNA。所建立的熒光PCR體系可特異檢測牛白血病病毒核酸，而對牛病毒性腹瀉一粘膜病毒(BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)以及羊胎腎細胞(FLK)、牛布魯氏菌擴增均呈陰性反應(yīng)，對pBST—pol重組質(zhì)粒的檢測敏感性可達0．32拷貝。重復(fù)性實驗的Ct值變異系數(shù)介于0．67～1．16之間，穩(wěn)定性實

2、驗的Ct值變異系數(shù)為3．14。采用建立的Taqman熒光PCR體系和OIE推薦的套式PCR對94份臨床樣品進行檢測，兩者定性符合率達到97．87。關(guān)鍵詞：牛白血病前病毒；Taqman熒光PCR；引物地方流行性牛白血病是由牛白血病病毒1．4陽性對照質(zhì)粒的構(gòu)建(BLV)引起的牛的一種慢性腫瘤性疾病。其特征BLV的pol基因由PCR擴增獲得，通過TA克為淋巴樣細胞惡性增生，進行性惡病質(zhì)和發(fā)病后的隆得到pBST—pol重組質(zhì)粒并經(jīng)序列證實，確定為高死亡率。此病在19世紀末被發(fā)現(xiàn)，但到1969該基因陽性質(zhì)粒后，用紫外分光光度計A26O／A28O年才由美國的Miller從

3、病牛外周血液淋巴細胞中吸光值測定質(zhì)粒濃度，一30℃保存?zhèn)溆谩BST質(zhì)分離到。目前此病遍及全世界，我國7O年代在安粒購自Novagen公司，膠回收試劑盒購自TAKA—徽發(fā)現(xiàn)首例后，繼而在各省市發(fā)生。近年，我國牛RA。群該病血清陽性率已從4％升高至3O1．5熒光PCR反應(yīng)體系的建立～60“。熒光PCR試驗在ABI7500熒光PCR儀上進目前對于牛群內(nèi)BLV感染的普查通?；谘校瑢σ餄舛取NTP濃度、探針濃度和熱啟動清學(xué)試驗如ELISA，可以很好地估計BLV在牛群Taq酶濃度等反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。dNTPs、Taq內(nèi)的流行情況。但樣品僅依靠血清學(xué)檢測并不酶等

4、均購自TAKARA公司，引物和探針由invitro—夠，Martin等報道同樣一批可疑樣品，間接gen公司合成。ELISA的檢出率為10，而依靠PCR方法的檢出1．6特異性、敏感性和重復(fù)性試驗率可達到17。對于大量樣品BLV的檢測，有必將牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病要建立特異性強、靈敏度高的PCR檢測方法，這有毒、牛布魯氏菌、羊胎腎細胞(FLK)作為4個對照樣利于針對牛白血病流行病學(xué)感染情況徹底進行本提取核酸，各取2作為模板進行PCR擴增，同調(diào)查。時設(shè)蒸餾水為陰性對照組。1材料和方法將計數(shù)后的pBST—pol質(zhì)粒進行1O倍梯度稀1．1病毒與臨床樣品釋，

5、陽性質(zhì)粒(3．2×10copies／mL)按1：10～1：牛病毒性腹瀉一粘膜病毒(BVDV，種毒10進行相同的3組稀釋，從每個梯度中各取3p．LAV69)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV，種毒模板進行熒光PCR檢測。AV20)、羊胎腎細胞(FIK)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察以相同稀釋度的陽性質(zhì)粒作為模板，并以10倍所，牛布魯氏菌樣本為牛布病II型活疫苗，血清學(xué)梯度稀釋成3個不同梯度的模板(1：10，1：10，陽性牛的EDTA抗凝血樣品由本中心采集保存。1：10。)，重復(fù)10次反應(yīng)。1．2核酸提取1．7熒光PCR與套式PCR的比對樣品的核酸提取采用AXYGEN公司Ax

6、yPrep1．7．1樣本的前處理：無菌尾根采集上海市1O個體液病毒DNA／RNA小量試劑盒(CatNo．規(guī)?；膛雠R床疑似牛EDTA抗凝血樣本共9451304)，一20℃保存?zhèn)溆?。份?℃冰箱待檢。樣本核酸提取參考AXYGEN1．3引物的設(shè)計公司AxyPrep體液病毒DNA／RNA小量試劑盒說采用AB公司Primer5．0軟件，根據(jù)BLVpol明書?；蛐蛄性O(shè)計的特異性引物和熒光探針序列如下：1．7．2套式PCR檢測：參考OIE推薦的套式PCR上游引物C1：5，_AACCCCACCTTCCCATGAC一引物序列合成，PCR結(jié)束后克隆取陽性重組質(zhì)粒進3’；下游

7、引物C2：5，_TGGTAGGAGGTTAATCT—行序列測定，最后將采集的94份全血樣品同時進行GATTGTGAGT一3’。FAM-CAGGCCCTTTCTC—熒光PCR方法檢測，將結(jié)果進行對比。GAGCCCTCTG—TAMRA引物由Invitrogen公司2結(jié)果合成并標記熒光基團，擴增全長71bp。2．1建立了3OuL熒光PCR反應(yīng)體系：上、下游