小鼠肝kupffer細胞分離方法探討

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1、小鼠肝Kupffer細胞分離方法探討作者：嚴茂林王耀東田毅峰賴智德周松強邱福南【摘要】　　目的探討分離BALB/c小鼠肝Kupffer細胞(KC)的方法。方法采用在體酶灌注和離體酶消化、不連續(xù)密度梯度離心、選擇性貼壁三步法分離KC，并比較鏈霉蛋白酶、Ⅳ型膠原酶及聯(lián)用鏈霉蛋白酶和Ⅳ型膠原酶等3種不同酶消化分離方法所得KC得率及純度。結(jié)果3種不同酶消化分離方法細胞得率分別為(6.32±0.5)×106g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106g-1；細胞純度分別為(93.2±1.7)％，(90.7±1.5)％，(94.5±1.9)％。結(jié)論聯(lián)合鏈霉蛋白酶

2、和Ⅳ型膠原酶在體灌注和離體消化是分離小鼠KC的較好方法?！娟P(guān)鍵詞】肝；枯否細胞；離心法,梯密度；小鼠，近交BABLc；細胞分離　　肝Kupffer細胞（Kupffer10cell,KC）為定居在肝竇內(nèi)的巨噬細胞，約占全身單核巨噬細胞總數(shù)的80％～90％。肝KC能吞噬、殺滅病原微生物，清除體內(nèi)的內(nèi)毒素，并具有抗原遞呈、分泌細胞因子等免疫調(diào)節(jié)作用，同時影響肝細胞、貯脂細胞及內(nèi)皮細胞的生物學(xué)功能[1]。近期發(fā)現(xiàn)KC能誘導(dǎo)同種異體T淋巴細胞凋亡，在調(diào)節(jié)肝移植免疫耐受中發(fā)揮重要作用[2]。如何獲得較多數(shù)量和較高純度的KC是研究其在機體中作用機制的首要條件。而傳統(tǒng)的分離方法往往因數(shù)量和純度

3、不足而影響實驗結(jié)果。本試驗采用在體酶灌注和離體酶消化、不連續(xù)密度梯度、選擇性貼壁三步法分離KC，探討分離小鼠肝KC的較好方法?！　?材料與方法　　1.1材料　　1.1.1實驗動物BABL/c小鼠，雄性，10～12周齡，清潔級，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心試驗動物中心提供（許可證號：046）。試驗前禁食12h，自由飲水，隨機分為3組?！　?.1.2主要試劑和儀器Ⅳ型膠原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES（美國Sigma公司）；兔抗人溶菌酶（lysozyme，美國DAKO公司）；鏈霉蛋白酶E（瑞士Roche公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）。超凈工作臺

4、（蘇州凈化設(shè)備廠），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），低溫高速離心機（美國Beckman公司）?！　?.1.3主要液體的配制（1）前灌注液（Hank's平衡鹽溶液）。KCl5mmol/L,KH2PO41mmol/L,NaCl115mmol/L,HEPES2510mmol/L。調(diào)整pH值為7.4。（2）后灌注液及酶消化液配制。后灌注液、酶消化液均由hank's平衡鹽溶液配制。方法1中的后灌注液含0.20％鏈霉蛋白酶2mL；酶消化液：含0.20％鏈霉蛋白酶2mL、0.012％DNAaseⅠ2mL；方法2中的后灌注液含0.025％Ⅳ型膠原酶2mL。酶消化液：含0.05％IV型膠原酶2

5、mL；方法3中的后灌注液含0.05％Ⅳ型膠原酶1mL、0.4％鏈霉蛋白酶1mL；酶消化液：含0.10％Ⅳ型膠原酶1mL、0.40％鏈霉蛋白酶1mL、0.012％DNAaseⅠ2mL；　　1.1.4SPS液的配制100％Percoll液和8.5%NS以9∶1的比例混合，配制成SPS原液；以70％Percoll液2mL配制：SPS1.4mL和PBS0.6mL混合配制所得；30％Percoll液的配制：PBS1.4mL和SPS0.6mL混合配制所得?！　?.1.5RPMI1640完全培養(yǎng)基的配制按說明書配制，0.22μm濾器過濾除菌，臨用前加入10％新鮮滅活的小牛血清，青霉素100

6、U/mL,鏈霉素100μg/mL?！　?.2BABL/c小鼠KC分離方法　　1.2.1原位肝臟灌注步驟參考文獻[3]。　　1.2.2肝臟非實質(zhì)細胞的提取及離心將上述肝細胞濾液4℃離心（800r/min×8min），取沉淀。加入PBS4mL，4℃離心（80r/min×3min），除去沉淀，取上清。加入PBS4mL充分混勻，再次以4℃10離心（150r/min×8min），取沉淀。沉淀加入PBS2mL,充分混勻。取10mL離心管1支，依次加入70％Percoll、30％Percoll、細胞懸液各2mL及少許PBS，4℃離心（1600r/min×22min）。離心管自上而下依次為：細

7、胞碎片、30％Percoll層、30％Percoll層與70％Percoll層之間的是大量KC及少量肝竇內(nèi)皮細胞、70％Percoll層、離心管底層為少許紅細胞。取30％Percoll和70％Percoll層之間的白色物，PBS8mL稀釋細胞，4℃離心1次（600r/min×8min），4℃分別離心（150r/min×8min）2次，除去上清。　　1.2.3KC貼壁培養(yǎng)將上述細胞沉淀用適量10％胎牛RPMI1640稀釋，取10μL用臺盼藍染色檢測細胞活性及細胞計數(shù)，分別計算3種方法的KC得率