Kupffer細胞分離培養(yǎng)

《Kupffer細胞分離培養(yǎng)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、肝臟巨噬細胞(KCs)的分離與培養(yǎng)研究生：魏思東戴卓婭導(dǎo)師：龔建平2010-05-04肝臟細胞懸液制備門靜脈穿刺，以10ml／min流量經(jīng)門靜脈灌注PBS，直至肝臟呈黃白色，總量約20ml。再用20ml0.05％的Ⅳ型膠原酶溶液(sigma，PBS液稀釋)門靜脈灌注(小鼠不用此步驟）。取下肝臟加入20ml0.05％膠原酶，37oC孵育40min，經(jīng)200目細胞篩過濾。PBS稀釋至50ml,300×g5min，4oC，離心洗滌2次，取沉淀PBS稀釋至50ml，用50g×g3min,4oC離心，棄沉淀，將上清液以300×g，5min,4oC離心，取沉淀。用鑷子劃碎肝組織裝入試管

2、消化肝臟消化吹打后細胞懸液細胞懸液過濾洗滌與肝細胞沉淀梯度離心Percoll原液9份加入1份PBS（10倍濃度）配成100%的SIP。取4支無菌離心管，沿著管壁加入2mL50％的SIP，然后傾斜（60o）試管，輕輕的沿著管加2mL25％的SIP細胞懸液（小鼠2管，大鼠4管）。500×g，離心15min，4oC，50％的SIP和25％的SIP層面之間有一層白色物，吸管輕輕的吸取之，置離心管中，用PBS離心清洗2遍，棄上清(300×g，5min)。非肝細胞SIP離心準備SIP離心后細胞層與洗滌細胞貼壁把細胞按5x105/ml濃度種植于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)2h。取出培養(yǎng)板，用37℃的PBS

3、液輕輕沖洗3次，去除未貼壁細胞，貼壁細胞即為實驗所用的KCs。剛分離出的細胞KCs的培養(yǎng)方法培養(yǎng)5％CO2、37℃、95％濕度。換液間隔時間為2d。培養(yǎng)基配方為DMEM（H）+雙抗+10%胎牛血清（HyClone）。2天及3天KCs2周及3周KCsKCs的鑒定活力判定通過形態(tài)學(xué)觀察及吞噬功能鑒定活力：在體外培養(yǎng)的24孔板細胞換液時，加入已消毒碳素墨水的培養(yǎng)基(1/250)，2h后倒置顯微鏡觀察，記數(shù)200個細胞，觀察具有吞噬功能的細胞數(shù)量。0.2%臺盼藍拒染色判斷細胞活力。F4/80免疫熒光鑒定KCs（小鼠），CD163免疫組化鑒定KCs（大鼠）,陽性為KCs。KCs吞墨圖像與

4、臺盼藍拒然圖片F(xiàn)4/80的免疫熒光和CD163免疫細胞化學(xué)(x400)致謝感謝連崢嶸，徐宇飛，柴躍龍，宗開燦，廖汪洋，陳琦，等同學(xué)。感謝其它關(guān)心和幫助我們的老師和同學(xué)。