小鼠肝kupffer細(xì)胞分離方法探討

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1、小鼠肝Kupffer細(xì)胞分離方法探討作者:嚴(yán)茂林王耀東田毅峰賴智德周松強(qiáng)邱福南【摘要】  目的探討分離BALB/c小鼠肝Kupffer細(xì)胞(KC)的方法。方法采用在體酶灌注和離體酶消化、不連續(xù)密度梯度離心、選擇性貼壁三步法分離KC,并比較鏈霉蛋白酶、Ⅳ型膠原酶及聯(lián)用鏈霉蛋白酶和Ⅳ型膠原酶等3種不同酶消化分離方法所得KC得率及純度。結(jié)果3種不同酶消化分離方法細(xì)胞得率分別為(6.32±0.5)×106g-1,(3.66±0.4)×106g-1,(10.3±0.7)×106g-1;細(xì)胞純度分別為(93.2±1.7)%,(90.7±1.5)%,(94

2、.5±1.9)%。結(jié)論聯(lián)合鏈霉蛋白酶和Ⅳ型膠原酶在體灌注和離體消化是分離小鼠KC的較好方法。【關(guān)鍵詞】肝;枯否細(xì)胞;離心法,梯密度;小鼠,近交BABLc;細(xì)胞分離  肝Kupffer細(xì)胞(Kupffercell,KC)為定居在肝竇內(nèi)的巨噬細(xì)胞,約占全身單核巨噬細(xì)胞總數(shù)的80%~90%。肝KC能吞噬、殺滅病原微生物,清除體內(nèi)的內(nèi)毒素,并具有抗原遞呈、分泌細(xì)胞因子等免疫調(diào)節(jié)作用,同時影響肝細(xì)胞、貯脂細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能[1]。近期發(fā)現(xiàn)KC能誘導(dǎo)同種異體T淋巴細(xì)胞凋亡,在調(diào)節(jié)肝移植免疫耐受中發(fā)揮重要作用[2]。如何獲得較多數(shù)量和較高純度的KC

3、是研究其在機(jī)體中作用機(jī)制的首要條件。而傳統(tǒng)的分離方法往往因數(shù)量和純度不足而影響實驗結(jié)果。本試驗采用在體酶灌注和離體酶消化、不連續(xù)密度梯度、選擇性貼壁三步法分離KC,探討分離小鼠肝KC的較好方法?! ?材料與方法  1.1材料  1.1.1實驗動物BABL/c小鼠,雄性,10~12周齡,清潔級,由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心試驗動物中心提供(許可證號:046)。試驗前禁食12h,自由飲水,隨機(jī)分為3組?! ?.1.2主要試劑和儀器Ⅳ型膠原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES(美國Sigma公司);兔抗人溶菌酶(lysozyme,美國DAK

4、O公司);鏈霉蛋白酶E(瑞士Roche公司);RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠),倒置顯微鏡(日本Nikon公司),低溫高速離心機(jī)(美國Beckman公司)。  1.1.3主要液體的配制(1)前灌注液(Hank's平衡鹽溶液)。KCl5mmol/L,KH2PO41mmol/L,NaCl115mmol/L,HEPES25mmol/L。調(diào)整pH值為7.4。(2)后灌注液及酶消化液配制。后灌注液、酶消化液均由hank's平衡鹽溶液配制。方法1中的后灌注液含0.20%鏈霉蛋白酶2mL;酶消化液:含0.20%鏈

5、霉蛋白酶2mL、0.012%DNAaseⅠ2mL;方法2中的后灌注液含0.025%Ⅳ型膠原酶2mL。酶消化液:含0.05%IV型膠原酶2mL;方法3中的后灌注液含0.05%Ⅳ型膠原酶1mL、0.4%鏈霉蛋白酶1mL;酶消化液:含0.10%Ⅳ型膠原酶1mL、0.40%鏈霉蛋白酶1mL、0.012%DNAaseⅠ2mL;  1.1.4SPS液的配制100%Percoll液和8.5%NS以9∶1的比例混合,配制成SPS原液;以70%Percoll液2mL配制:SPS1.4mL和PBS0.6mL混合配制所得;30%Percoll液的配制:PBS1.4

6、mL和SPS0.6mL混合配制所得。  1.1.5RPMI1640完全培養(yǎng)基的配制按說明書配制,0.22μm濾器過濾除菌,臨用前加入10%新鮮滅活的小牛血清,青霉素100U/mL,鏈霉素100μg/mL。  1.2BABL/c小鼠KC分離方法  1.2.1原位肝臟灌注步驟參考  2結(jié)果  2.1熒光顯微鏡觀察在328nm熒光激發(fā)下,未見KC發(fā)出熒光。  2.2KC的形態(tài)變化新鮮分離的KC呈圓形,細(xì)胞核大,細(xì)胞質(zhì)少,折光性較強(qiáng),遠(yuǎn)小于肝細(xì)胞,接種1h后少部分細(xì)胞已貼壁;培養(yǎng)24h后,多數(shù)細(xì)胞已伸展;培養(yǎng)48h后,絕大多數(shù)細(xì)胞已貼壁,且充分伸展

7、,可見星形或不規(guī)則形;方法3所得KC培養(yǎng)24h后的細(xì)胞貼壁及形態(tài)情況(圖1A)?! C:肝Kupffer細(xì)胞.A:KC培養(yǎng)24h后的形態(tài)(×10);B:KC培養(yǎng)6h后吞噬試驗(×10);C:KC培養(yǎng)48h后免疫組織化學(xué)圖像(×20).  圖1KC培養(yǎng)24h后的形態(tài)、6h后的吞噬試驗、48h后的免疫組織化學(xué)表現(xiàn)(略)  Fig1MorphousofKCafter24hoursculture,thephagocytosistestofKCafter6hoursculture,immunohistochemistryofKCafter48hour

8、sculture  2.33種方法分離的KC活力、得率及純度情況(表1)?! ”?3種分離方法細(xì)胞得率及細(xì)胞純度的比較(略)  Tab1parisontheyiel

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