麥芽醇對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響

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1、麥芽醇對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響【關(guān)鍵詞】麥芽醇；腦缺血再灌注；一氧化氮合酶ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectofmaltolontheexpressionofnNOSafterfocalcerebralischemia/reperfusioninrats.MethodsThemodelofischemia/reperfusioninjuryporarymiddlecerebralarteryocclusion(MCAO).TheexpressionofnNOSmunohistochemistry.Resu

2、ltsTheexpressionofnNOSia/reperfusion.ApplicationofmaltolcouldinhibittheexpressionofnNOS.ConclusionMaltolhasaprotectetiveeffectoncerebralischemia/reperfusioninjurybyreducingtheexpressionofnNOS.KEYaltol;Cerebralischemiareperfusion;NOS目前已經(jīng)確定的一氧化氮合酶的亞型有3種，分別稱為神經(jīng)元型NOS(neuronalNOS,nNOS),誘

3、導(dǎo)型NOS(inducibleNOS,iNOS)和內(nèi)皮型NOS(endotheialNOS,eNOS)。腦缺血再灌注損傷后NOS活性明顯增加，加重局灶性腦缺血損傷[1]。麥芽醇是從紅參中提取的單體化合物，其在體內(nèi)外可與自由基結(jié)合，對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[2,3]。為了深入研究麥芽醇抗腦缺血的機(jī)制，本文觀察了麥芽醇對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元型NOS的影響。1材料與方法1.1試驗(yàn)動物和分組成年健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量230～280g，清潔級，咸寧學(xué)院醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為對照組、缺血再灌注組和麥芽醇組，每組12只。1.2大腦中動脈閉

4、塞（MCAO）再灌注模型的建立參照Koizumi等[4]方法制作大鼠左側(cè)大腦中動脈阻塞及再灌流模型。采用10％水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉,術(shù)中維持動物肛溫(36.6±0.5)℃，頸部正中切口，分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動脈、頸外動脈,注意避免刺激迷走神經(jīng)。從頸總動脈分叉處插入4.0絲線,沿頸內(nèi)動脈進(jìn)入距頸總動脈分叉處1.8～2.0cm略感阻力時停止；30min后拔出絲線進(jìn)行缺血再灌流。術(shù)后在約20℃的空調(diào)環(huán)境下單籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食、進(jìn)水。對照組只暴露血管。1.3給藥方法參考有關(guān)文獻(xiàn)[4]麥芽醇組分別在缺血前和缺血后30min經(jīng)尾靜脈注射2ml700μmol/L

5、麥芽醇生理鹽水。1.4免疫組化檢測nNOS的表達(dá)大鼠在腦缺血30min再灌注24h后經(jīng)水合氯醛腹腔麻醉，開胸經(jīng)主動脈插管，剪開右心房，以200ml生理鹽水經(jīng)升主動脈快速沖洗。隨后灌注冷的(4℃)4%多聚甲醛固定液350ml，開顱取出全腦，修塊保留缺血中心區(qū)(前囟后1.8mm)后固定于相同固定液中6h，入25%蔗糖至組織塊下沉。AO恒冷箱切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚20μm。對腦組織冰凍切片進(jìn)行nNOS表達(dá)的檢測，蒸餾水新鮮配置3%H2O2，室溫浸泡5～10min以滅活內(nèi)源性酶，滴加正常山羊血清30min，不洗，甩去多余液體；滴加兔抗鼠nNOS一抗(1∶400，北京

6、中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫下(25℃)孵育2h，然后在4℃下過夜，PBS洗；滴加生物素化山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司二抗試劑盒)，室溫下30min，PBS洗；滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素稀釋液,室溫孵育45min，PBS洗10min×3次；DAB顯色，室溫下15min，雙蒸水多次洗滌；脫水、透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈棕黃色顆粒。2結(jié)果nNOS免疫反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物為棕褐色顆粒或點(diǎn)狀，分布于胞漿。缺血再灌注組nNOS在皮層大量表達(dá)，與正常對照組相比染色明顯加深。麥芽醇組nNOS在皮層陽性表達(dá)與缺血再灌注組比較染色明顯減弱（圖1）。

7、對各組大鼠皮層經(jīng)HPIAS100高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)測定其吸光度，并經(jīng)包于該系統(tǒng)內(nèi)的統(tǒng)計軟件處理（方差分析），定量分析結(jié)果顯示缺血再灌注組nNOS在皮層的吸光度（9.25±0.22）較正常對照組（7.66±0.32）相同腦區(qū)顯著上升(P<0.05)；麥芽醇組在皮層吸光度（7.66±0.32）較缺血再灌注組顯著降低(P<0.05)。3討論NO是一種自由性質(zhì)的氣體，為較小的生物活性分子，可自由穿過細(xì)胞膜，作用于細(xì)胞內(nèi)的靶分子。機(jī)體內(nèi)NO過量的生成可直接抑制有關(guān)酶的活性,可與超氧化物歧化物結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞的損傷[5,6]。有研究表明NO在腦缺血性損

8、傷的發(fā)病中起重要作用，缺血后數(shù)分鐘NO