麥芽醇對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后inos的影響

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1、麥芽醇對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后iNOS的影響【摘要】目的觀察麥芽醇對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的影響。方法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)再灌流模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腦組織中iNOS的表達(dá)。結(jié)果腦缺血再灌注損傷后，腦組織中iNOS表達(dá)明顯增強(qiáng)，給予麥芽醇后，iNOS表達(dá)減弱。結(jié)論麥芽醇可抑制iNOS表達(dá)，對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】麥芽醇;腦缺血;再灌注損傷;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶　　ABSTRACT：ObjectiveToinvestigatetheeffectsofmaltolontheexpressionofiNOSafterf

2、ocalcerebralischemiareperfusioninjuryinrats.MethodsThemodelofischemiareperfusioninjuryiddlecerebralarteryocclusion(MCAO).TheexpressionofiNOSmunohistochemistry.ResultsTheexpressionofiNOSiareperfusion.TreatmentaltolcouldmarkedlyinhibittheexpressionofiNOS.Conclusionmaltolmayprotectcerebralischemiarep

3、erfusioninjurybyreducingtheexpressionofiNOS.　　KEYaltol;Cerebralischemia;Reperfusioninjury;Induciblenitricoxidesynthase　　目前已經(jīng)確定的一氧化氮合酶亞型有3種，分別稱為神經(jīng)元型NOS(neuronalNOS,nNOS)、誘導(dǎo)型NOS(inducibleNOS,iNOS)和內(nèi)皮型NOS(endotheialNOS,eNOS)。腦缺血再灌注損傷后NOS活性明顯增加，加重局灶性腦缺血損傷[1]。麥芽醇是從紅參中提取的單體化合物，其在體內(nèi)外可與自由基結(jié)合，對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作

4、用[2，3]。為了深入研究麥芽醇抗腦缺血的機(jī)制，我們觀察了麥芽醇對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后iNOS的影響?！　?材料與方法　　1.1試驗(yàn)動(dòng)物和分組　　成年健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量230～280g，清潔級(jí)，武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血再灌注組和麥芽醇組，每組12只?！　?.2大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)再灌注模型的建立　　參照Koizumi等[4]方法制作大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞及再灌流模型。采用10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉,術(shù)中維持動(dòng)物肛溫(36.6±0.5)℃，頸部正中切口，分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,注意避免刺激迷走神經(jīng)。從頸總動(dòng)脈

5、分叉處插入4.0絲線,沿頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入距頸總動(dòng)脈分叉處1.8～2.0cm略感阻力時(shí)停止;30min后拔出絲線進(jìn)行缺血再灌注。術(shù)后在約20℃的空調(diào)環(huán)境下單籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食、進(jìn)水。對(duì)照組只暴露血管?！　?.3麥芽醇給藥　　參考有關(guān)文獻(xiàn)[5]，麥芽醇組分別在缺血前和缺血后30min經(jīng)尾靜脈注射2ml700μmol/L麥芽醇生理鹽水。　　1.4免疫組化檢測(cè)iNOS的表達(dá)　　大鼠在腦缺血30min再灌注24h后經(jīng)水合氯醛腹腔麻醉，開胸經(jīng)主動(dòng)脈插管，剪開右心房，以200ml生理鹽水經(jīng)升主動(dòng)脈快速?zèng)_洗。隨后灌注冷的(4℃)4%多聚甲醛固定液350ml，開顱取出全腦，修塊保留缺血中心區(qū)(前囟后1.8mm)后

6、固定于相同固定液中6h，入25%蔗糖至組織塊下沉。AO恒冷箱切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚20μm。對(duì)腦組織冰凍切片進(jìn)行iNOS表達(dá)的檢測(cè)，蒸餾水新鮮配置3%H2O2，室溫浸泡5～10min以滅活內(nèi)源性酶，滴加正常山羊血清30min，不洗，甩去多余液體;滴加兔抗鼠iNOS一抗(1∶400，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫下(25℃)孵育2h，然后在4℃下過(guò)夜，PBS洗;滴加生物素化山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,二抗試劑盒)室溫下30min，PBS洗;滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素稀釋液,室溫孵育45min，PBS洗10min×3次;DAB顯色，室溫下15min，雙蒸水多次洗滌;脫

7、水、透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色顆粒。　　1.5圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　　每組動(dòng)物取10張切片，每張切片選取左右皮層，用HPIAS100高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)對(duì)其免疫反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行吸光度測(cè)定。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)用SPAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，并以方差分析，P0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。　　2結(jié)果　　iNOS免疫反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物為棕褐色顆?；螯c(diǎn)狀，分布于胞漿。缺血再灌注組i