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1、錳對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及半胱天冬酶表達(dá)影響論文【關(guān)鍵詞】錳;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;凋亡;半胱天冬酶3(caspase3);半胱天冬酶8(caspase8)摘要：目的探討錳對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC-304細(xì)胞生長周期及半胱天冬酶3(caspas3)、半胱天冬酶8(caspase8)表達(dá)的影響。方法以100～800μmoml/L)的氯化錳分別處理HUVEC-304細(xì)胞24～72h后，四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)法檢測EVC-304細(xì)胞的生長活性；流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞凋亡情況；蛋白印跡法（TTassay.Apoptosisetry(FCM).Th
2、eexpressionofcaspase3andcaspase8easuredbyTTresultsrevealedthatmanganesechloride(from100to800μmol/L)mightsuppresstheproliferationofHUVEC-304cells(inhibitoryratioe-dependentmanner.TheresultofanganesecaninhibitproliferationofHUVEC-304cellse-anddose-dependentmanner.Thesemaybeoneo
3、fimportantmechanismsthatmanganesesuppressedtheproliferationofHUVEC-304cellsandinducedapoptosis.Keyanganese;HUVEC-304cells;apoptosis;caspase3;caspase8錳可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生不配對的電子自由基形成大量的過氧化物及影響細(xì)胞能量代謝等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮毒性作用〔1,2〕,但對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因半胱天冬酶8(caspase8)、半胱天冬酶3(caspase3)及蛋白產(chǎn)物的影響研究較少。本研究通過體外試驗(yàn).f
4、reela公司)。caspase3、caspase8一抗為鼠抗人，二抗為羊抗鼠(美國晶美生物工程有限公司)。12方法121細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)HUVEC-304細(xì)胞株(武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心)。在含有10%的胎牛血清、青霉素100u/ml及鏈霉素100mg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基中37℃、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期、生長良好、細(xì)胞活性大于98%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。122細(xì)胞生長活性檢測采用MTT比色法，取對數(shù)生長期的HUVEC～304細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將不同濃度的氯化錳100～800μmol/L加入10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640
5、的培養(yǎng)基中，調(diào)細(xì)胞濃度為5×105/ml，接種于96孔，每種劑量濃度為一組，每個(gè)濃度3個(gè)平行孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)不同時(shí)間（24，48，72h）后，每孔加20μlMTT，培養(yǎng)4h，棄MTT，每孔加DMSO150μl，充分溶解。選擇490nm波長，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度(A)值。HUVEC-304細(xì)胞的生長抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值）×100%。123流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡用熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin-V-FITC)及碘化丙啶（PI）雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，分為不同濃度實(shí)驗(yàn)組及對照組。分別加入終
6、濃度為100～800μmol/L的氯化猛作用24h，用70%乙醇4℃固定2h，磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液洗3次，離心去上清。用結(jié)合緩沖液37℃孵育60min，195μl細(xì)胞懸液加5μlAnnexin-V-FITC，混勻，室溫10min。用緩沖液洗滌細(xì)胞1次，在190μl結(jié)合緩沖液中重懸，然后再加10μl20μg/mlPI，流式細(xì)胞儀檢測。124細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品制備及蛋白定量經(jīng)處理后的細(xì)胞立即棄去培養(yǎng)液,洗滌,離心,加預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(01mol/LNaCl,001mol/LTrisHCl,pH76,.freelol/L乙二胺四醋酸（EDTA）,1
7、00μg/ml蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF),2μg/mL，亮肽素(Leupeptin)01ml,裂解30min,然后于10000g離心10min,取上清備用。以上所有操作均在4℃下進(jìn)行。測定蛋白,并調(diào)各組蛋白濃度一致。125蛋白印跡法(nCl2培養(yǎng)HUVEC-304細(xì)胞24h,即可引起細(xì)胞明顯凋亡,并隨氯化錳劑量的增加呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。表1不同濃度氯化錳誘導(dǎo)HUVEC-304細(xì)胞的凋亡率（略）注：與對照比較，*P＜001；n=323錳對HUVEC-304細(xì)胞caspase3、caspase8表達(dá)的影響aleckiEA.Manganeset
8、oxicityisassociationinrasprimarystriatalneurons［J］.BrainResBull,2001
