大黃蟲丸預(yù)防dmn誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的作用及其機(jī)制研究

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1、大黃蟲丸預(yù)防DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的作用及其機(jī)制研究【摘要】觀察大黃蟲丸預(yù)防大鼠肝纖維化的作用。［方法］二甲基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，同時(shí)用大黃蟲丸進(jìn)行預(yù)防，觀察其對(duì)大鼠血清ALT、AST，肝組織的纖維化程度、血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）及其mRNA的表達(dá)、以及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶mRNA表達(dá)的影響。［結(jié)果］大黃蟲丸可降低大鼠血清ALT、AST水平，減輕肝纖維化程度，降低大鼠肝組織AT1R及其mRNA表達(dá)。［結(jié)論］大黃蟲丸能部分抑制大鼠肝纖維化時(shí)肝組織AT1R及其mRNA的過度表達(dá)?！娟P(guān)鍵詞】大黃蟲丸；肝纖維化；血管緊張素Ⅱ1型受體

2、；二甲基亞硝胺；大鼠Fundproject：ItemsupportedbyZhejiangProvincialEducationalBureau（No：20071096）大黃蟲丸系《金匱要略》治療干血?jiǎng)诘拿?，抗肝纖維化療效確切［1］，但其抗肝纖維化作用機(jī)制是否與肝局部RAS相關(guān)未見報(bào)道。本研究采用二甲基亞硝胺（DMN）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，運(yùn)用大黃蟲丸進(jìn)行預(yù)防，以觀察其對(duì)肝組織AT1R的影響，同時(shí)觀察其對(duì)肝組織AT1R與ACEmRNA表達(dá)的影響，從肝局部RAS角度初步探討大黃蟲丸抗肝纖維化的作用機(jī)制?！　?實(shí)驗(yàn)材料　　1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物　

3、　清潔級(jí)SD大鼠60只，雄性，體重（160±20）g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供?！　?.2藥品與試劑　　大黃蟲丸購自湖南回春堂藥業(yè)有限公司；復(fù)方鱉甲軟肝片購自內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司；二甲基亞硝胺購自天津市化學(xué)試劑公司。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒均購自上海科欣生物技術(shù)研究所；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；AT1R免疫組化試劑盒和DAB顯色劑試劑盒購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司；RT-PCR試劑盒購自上?？蒲由锛夹g(shù)有限公司。　　1.3實(shí)驗(yàn)儀器　　組織切片機(jī)（德國Leca公司），恒

4、溫水浴箱（江蘇太倉醫(yī)用儀器廠），PCR循環(huán)儀（德國Biometra公司），多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國MediaCyberics公司），GIS凝膠圖像分析處理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），電泳儀（北京市六一儀器廠）?！　?方法　　2.1造模及分組　　將大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為正常對(duì)照組，模型組，大黃蟲丸低劑量組，大黃蟲丸中劑量組，大黃蟲丸高劑量組（分別簡稱低、中、高劑量組），復(fù)方鱉甲軟肝片陽性對(duì)照組（簡稱陽性對(duì)照組）。除正常對(duì)照組大鼠外，其余50只大鼠按10mg/kg體重腹腔注射1%濃度的DMN生理鹽水溶液進(jìn)行造模

5、，每周連續(xù)3d，共4周12次?！　?.2實(shí)驗(yàn)用藥　　將大黃蟲丸與復(fù)方鱉甲軟肝片分別用蒸餾水溶解制成混懸液，按人與大鼠體表面積比折算的等效劑量給藥。造模同時(shí)即開始給藥預(yù)防。大黃蟲丸低、中、高劑量組分別按0.54g/kg、1.08g/kg、2.16g/kg體重灌胃給藥，復(fù)方鱉軟肝片按1g/kg體重灌胃給藥。模型組與正常組按蒸餾水10ml/kg體重灌胃，各組均每天灌胃1次，連續(xù)給藥4周至造模結(jié)束?！　?.3大鼠處理方法　　末次給藥當(dāng)晚禁食不禁水，次日上午空腹按40mg/kg劑量腹腔注射1%的戊巴比妥麻醉，腹腔靜脈采血，離心機(jī)分離取血清，-20

6、℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｑ杆俜蛛x肝臟，取大鼠肝左葉肝組織入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定，逐級(jí)酒精脫水，經(jīng)透明、常規(guī)石蠟包埋，用作肝組織HE染色、苦味酸-天狼紅膠原染色及免疫組織化學(xué)染色指標(biāo)的檢測。其余新鮮肝臟經(jīng)生理鹽水清洗后立即投入液氮中凍存，3小時(shí)后移入-80℃低溫冰箱中保存，用于提取總RNA。　　2.4引物設(shè)計(jì)與合成　　從GeneBank數(shù)據(jù)庫中獲得大鼠基因AT1R、ACEmRNA全序列，以及內(nèi)參β—肌動(dòng)蛋白（β-actin）mRNA序列，利用primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出上、下游特異性引物。大鼠AT1R引物序列：上游引物為5’-CA

7、CGCTTTCTTACCG-3’，下游引物為5’-TGACTACAGGGACAACA-3’；ACE引物序列：上游引物為5’-CGTGGAGGAGTATGACC-3’，下游引物為5’-CAGAGTAGCCGTTGAGC-3’；β-actin引物序列：上游引物為5’-ATGCCATCCTGCGTCTG-3’，下游引物為5’-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3’。引物由上海博尚生物科技有限公司合成?！　?.5觀察指標(biāo)及檢測方法　　血清ALT、AST采用賴氏法檢測，按試劑盒說明書步驟操作。肝組織行HE和苦味酸—天狼紅染色，光鏡下觀察肝

8、組織病理變化與肝纖維化程度，依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝纖維化組織學(xué)Ⅵ級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和改良的Chevallier肝纖維化SSS半定量計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肝纖維化程度評(píng)判［23］。肝組織AT1R的表達(dá)按鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接