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1、外周血單個核細(xì)胞HBV的復(fù)制狀態(tài)與干擾素作者：陳天艷，陳瑞琳，藺淑梅，葉峰，張曦，陳云茹，趙英仁，張樹林【摘要】 目的:研究HBV侵犯外周血單個核細(xì)胞（PBMC）及對IFN-γ表達(dá)和分泌的影響.方法:慢性HBV感染者60例，巢式PCR檢測PBMC中HBV共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）；ELISA法檢測血清IFN-γ水平；實時定量RT-PCR方法檢測PBMC中IFN-γmRNA的表達(dá)水平.結(jié)果:48.3%（29/60）的患者PBMC中檢測到cccDNA；血清IFN-γ水平低于對照組（P＜0.05）；PBMC中IFN-γmRNA表達(dá)水平低于對照組（P＜0.01）；PBMC中c
2、ccDNA陽性組IFN-γ表達(dá)和分泌水平低于cccDNA陰性組（P＜0.01）.結(jié)論：HBV慢性感染者PBMC中IFN-γ表達(dá)和分泌水平降低.【關(guān)鍵詞】肝炎病毒乙型DNA環(huán)狀外周血單個核細(xì)胞干擾素Ⅱ型 【Abstract】AIM:Tostudyhoplifiedbynest-PCR.ThelevelofIFN-γintheseruminedbyELISA.TheexpressionofIFN-γmRNAinPBMCinedbyreal-timeRT-PCR.RESULTS:HBVcccDNAinPBMCinedby48.3%（29/60）inpatients.Theserum
3、levelofIFN-γinthepatientsonocytes;interferontypeⅡ 0引言 HBV感染慢性化是機(jī)體免疫功能紊亂，主要是細(xì)胞免疫功能低下所致，Th1/Th2細(xì)胞亞群的失衡與HBV持續(xù)感染密切相關(guān).IFN-γ主要由活化的Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，可通過多種途徑直接或間接促進(jìn)Th1應(yīng)答，提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），自然殺傷細(xì)胞（NK），單核-巨噬細(xì)胞活性，在清除HBV感染的細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用.IFN-γ活性水平直接反映了Th1細(xì)胞的功能，與HBV感染后的最終結(jié)局密切相關(guān).因此，在證實HBV侵犯PBMC基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步比較慢性HBV感染
4、者PBMC中cccDNA陽性和陰性組IFN-γ表達(dá)和分泌水平，以了解HBV侵犯PBMC并在其中復(fù)制對免疫細(xì)胞功能的影響. 1材料和方法 1.1材料2007-01/2007-05慢性HBV感染者60(男43，女17)例，年齡15～52（平均34.7）歲.診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年制定的《病毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn).所有患者均排除HAV，HCV，HDV，HEV，柯薩奇病毒等感染和藥物、酒精等其他原因造成的肝臟損害.健康對照者30例，均來自西安市健康獻(xiàn)血員.無菌采集未抗凝靜脈血2mL,-4℃離心后立即分離血清，-20℃凍存；肝素抗凝靜脈血10mL，常規(guī)密度梯度法分離淋巴細(xì)胞，洗滌細(xì)胞5
5、次，分別收集第5次洗液和細(xì)胞.將細(xì)胞分2份，一份-70℃保存，用于檢測乙肝病毒核酸；另一份按1×1010/L細(xì)胞密度加入1mLTrizolReagent，-70℃凍存，用于提取總RNA.TrizolReagent(美國invitrogen公司),綠豆芽核酸酶（MBN）（美國Promega公司）,HighPureViralNuclEicAcid試劑盒（Roche公司）,Rer-vertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas公司),HumanIFN-γELISAKit(美國Bender公司),擴(kuò)增引物均由大連Takara公司設(shè)計和合成.
6、 1.2方法用HighPureViralNuclEIcAcid試劑盒提取PBMC中病毒核酸.MBN反應(yīng)體系：10×緩沖液1μL；8.33nkatMBN1μL；HBV核酸樣品5μL；純水補(bǔ)足體積至10μL.37℃孵育5min后立即置于冰水浴中，加1mol/LTris-Cl(ph8.0)2μL終止反應(yīng)，總體積12μL.HBVcccDNA引物設(shè)計參照參考 A：首輪PCR.3：陽性對照，5～6：陰性、空白對照；1～2標(biāo)本；B：次輪1：陽性對照；2，5：陰性、空白對照；4：標(biāo)本. 圖1PBMC中cccDNA電泳圖（略） 2.2血清中IFN-γ水平慢性HBV感染者血清IFN-γ水平
7、低于對照組（t=3.572，P＜0.05）；PBMC中IFN-γmRNA表達(dá)水平低于對照組（t=2.734，P＜0.01，表1）. 表1慢性HBV感染者PBMCs分泌IFN-γ水平（略） aP＜0.05,bP＜0.05vs對照. 2.3PBMC中cccDNA和IFN-γ表達(dá)和分泌的關(guān)系慢性HBV感染者PBMC中cccDNA陽性組IFN-γ表達(dá)和分泌水平低于陰性組（t=2.256，P＜0.01,表2）. 表2慢性HBV感染者PBMC中cccDNA和IFN-γ表達(dá)和分泌水平（略） bP
