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《畢赤酵母異源表達(dá)幾丁質(zhì)酶對(duì)大豆核盤菌的生防潛能分析》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、畢赤酵母異源表達(dá)幾丁質(zhì)酶對(duì)大豆核盤菌的生防潛能分析 摘要：將來(lái)自于棘孢木霉的幾丁質(zhì)酶基因整合到了畢赤酵母基因組中，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了生防潛能分析。結(jié)果表明，pH值為6和溫度為40℃時(shí)幾丁質(zhì)酶活性最高，表達(dá)產(chǎn)物能夠顯著抑制大豆核盤菌的生長(zhǎng)，并通過(guò)誘導(dǎo)ROS積累和抗性酶活性提高大豆對(duì)核盤菌的抗性。 關(guān)鍵詞：幾丁質(zhì)酶；異源表達(dá)；酶學(xué)特性；生防潛能 中圖分類號(hào)：S476文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.11.002 Abstract：ChitinasefromTrichodermaviridewasexpressedinPi
2、chiapastoris，andthebiocontrolpotentialwasanalyzed.TheresultsshowedthatChitinasehadthehighestactivitywhenpHwas6andtemperaturewas40℃.Furthermore，ChitinasesignificantlyinhibitedthegrowthofSclerotiniasclerotiorumandimprovedtheresistancetosclerotiorumbyinducingROSaccumulationandtheactivityofresi
3、stantenzymes. Keywords：Chitinase；heterologousexpression；biocontrolpotential 大豆（Glycinemax（L.）Merrill）是世界上重要的植物油和蛋白來(lái)源。核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）de9Bary）引起的大豆菌核病是一種世界性的大豆病害，是影響大豆產(chǎn)量的第二大病害因素[1]。與化學(xué)防治相比，生物防治可以有效克服污染環(huán)境、危害人畜健康等缺點(diǎn)，并因此成為當(dāng)前植物病害防治研究的熱點(diǎn)之一。 木霉（Trichodermaspp.）是世界上公認(rèn)的生防菌，抗真菌代謝物
4、在木霉的生防功能中起著重要作用。幾丁質(zhì)酶就是一類重要的抗真菌代謝物，能夠水解真菌細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)[2-3]，從而抑制真菌的生長(zhǎng)。已有研究表明，該基因的表達(dá)能夠增強(qiáng)植物對(duì)多種病原菌的抗性。與非轉(zhuǎn)基因植株相比，表達(dá)木霉幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotianatabacum）和土豆（Solanumtuberosum）對(duì)交鏈孢霉（Alternariaalternata）、茄鏈格孢（Alternariasolani）和灰葡萄孢菌（Btrytiscinerea）、立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）[4]，蘋果（Maluspumila）對(duì)黑星病菌（Venturiaina
5、equalis）[5]，檸檬（Citruslimon）對(duì)莖點(diǎn)霉（Phomatracheiphila）和灰霉病菌（Botrytiscinerea）[6]的抗性都顯著增強(qiáng)，表明幾丁質(zhì)酶對(duì)于增強(qiáng)植物的抗病性具有重要作用。筆者研究了畢赤酵母異源表達(dá)的棘孢木霉幾丁質(zhì)酶對(duì)大豆核盤菌的生防機(jī)制，為幾丁質(zhì)酶應(yīng)用于植物病害防治提供理論依據(jù)?！ ?材料和方法 1.1材料 PDA培養(yǎng)基：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，pH值6.0定容至1L；幾丁質(zhì)酶基因（Tachi）來(lái)自于棘孢木霉（T.asperellum），酵母表達(dá)載體pPIC9K本實(shí)驗(yàn)室保存?！ ?.2方法9 1.2.1畢赤酵
6、母表達(dá)載體構(gòu)建在棘孢木霉幾丁質(zhì)酶基因（Tachi）的CDS序列兩端引入BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收目的片段。采用BamHI和KpnI雙酶切，將目的片段連入pPIC9K載體，獲得pPIC9K-Tachi重組質(zhì)粒，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切檢測(cè)。根據(jù)pPIC9K載體的多克隆位點(diǎn)和Tachi基因序列設(shè)計(jì)并合成以下引物序列：Chi1：5―ATCGGAATTCATGGTCCCTCAGTCTCGAGCC―3EcoRI（劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)）；Chi25―CGATGGTACCTTATTCGTCAAGCCCTCTCTT―3（劃線部分為KpnI酶切位點(diǎn)）?！ ?/p>
7、1.2.2pH值和溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的影響在分析pH值和溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的影響時(shí)，將酶液分別加入不同pH值（3，4，5，6，7，8，9）的磷酸緩沖液中，首先找出最適pH值，然后在最適pH值條件下，反應(yīng)溫度分別設(shè)定為20，30，40，50，60℃，分別測(cè)定溫度對(duì)酶活性的影響。酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[7]的方法。 1.2.3幾丁質(zhì)酶抑菌活性測(cè)定將培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上的大豆核盤菌菌塊用打孔器切成直徑為5mm的菌盤，接種到含有幾丁質(zhì)酶液的PDA培養(yǎng)基平板的中央，28℃培養(yǎng)5d后，測(cè)量菌盤生長(zhǎng)直徑，同時(shí)以菌盤接種
