sirna抑制stgc3基因表達對nih3t3細胞增殖的影響

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1、siRNA抑制STGC3基因表達對NIH3T3細胞增殖的影響碩士研究生：廖銀花指導教師：賀修勝教授中文摘要目的：STGC3基因是新近克隆的一個候選抑瘤基因。本研究以STGC3基因陽性表達的鼠成纖維細胞系NIH3T3細胞為模型，采用siRNA技術，使NIH3T3細胞的STGC3基因表達下調，觀察STGC3基因表達下調對NIH3T3細胞增殖的影響。方法：構建了針對STGC3基因mRNA的pSilencer3．1-STGC3一siRNA表達載體，經(jīng)脂質體轉染，導入NIH3T3細胞，G418篩選，建立穩(wěn)定的pSilencer3．1．STGC3一siRNA／NIH3T

2、3細胞系。RT-PCR、Westernblotting和免疫細胞化學方法，檢測STGC3基因mRNA和蛋白表達。通過HE染色、繪制生長曲線、軟瓊脂集落形成實驗及流式細胞儀分析，觀察STGC3基因表達下調后，NIH3T3細胞形態(tài)、增殖速度、克隆形成率和細胞周期分布變化。結果：重組質粒DNA經(jīng)酶切和測序鑒定，結果均證實pSilencer3．1-STGC3一siRNA表達載體構建成功。將pSilencer3．1-STGC3．siRNA和pSilencer3．1質粒分別轉染NIH3T3細胞，G418篩選陽性細胞克隆，經(jīng)RT-PCR、Westemblotting及免疫

3、細胞化學方法檢測結果表明，成功建立了STGC3基因表達下調的NIH3T3細胞系。普通光學顯微鏡下觀察，pSilencer3．1-STGC3一siRNA／NIH3T3細胞與兩對照組相比，核染色加深，細胞變得細長；細胞生長曲線結果顯示：pSilencer3．1-STGC3-siRNA／NIH3T3細胞較pSilencer3．1／NIH3T3細胞和NIH3T3細胞生長速度快(P

4、4+1．O)％、(2．2+0．3)％和(2．1+0．3y％，4pSilencer3．1一STGC3．siRNA／NIH3T3組克隆形成能力較兩對照組顯著增強(P<0．05)；流式細胞儀檢測結果：pSilencer3．1一STGC3一siRNA／NIH3T3組較對照組細胞群體中處于S期和G2的細胞數(shù)目增加，Go／Gl期細胞數(shù)目減少。結論：1．構建了pSilencer3．1-STGC3一siRNA真核表達載體。2．建立了STGC3基因表達下調的pSilencer3．1．STGC3．siRNA／NIH3T3細胞系。3．siRNA抑制STGC3基因表達可促進NIH3

5、T3細胞增殖。關鍵詞：小干擾RNA，STGC3基因，NIH3T3細胞，細胞增殖5EffectofSTGC3．siRNAontheGrowthinNIH3T3CellLineAbstractObjective：STGC3geneisacandidatetumorsuppressorgeneclonedrecently．NIH3T3celllinewasselectedas．a(chǎn)targetwithpositiveexpressionofSTGC3geneandobservedtheproliferationeffectafterSTGC3geneexpressi

6、oninhibitedbysiRNA．Methods：pSilencer3．1-STGC3-siRNAexpressionvectortargettingSTGC3geneWasconstructedandtransfectedintoNIH3T3celllinebycationicliposome．ThestablepSilencer3．1-STGC3-siRNA／NIH3T3celllineWasobtainedbyG418selection．ThelevelsofSTGC3mRNAandproteinweredetectedbyRT-PCR，weste

7、rnblottingandimmunohistochemistry．Cellmorphology,growthcurves，colonyformationrateandcellcycledistributionweredetectedinNIH3T3celllineafterSTGC3geneexpressiondown—regulated．Results：TheresultsofrestrictionenzymecuttingandDNAsequencingdemonstratethatthepSilencer3．1一STGC3一siRNAexpressi

8、onvectorWassuccessfullycon