分子生物學(xué)-根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)柑橘愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化

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1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)柑橘愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化1柑桔材料的準(zhǔn)備不同品種的柑桔胚性愈傷組織保存于MT固體培養(yǎng)基上，每20-25d繼代一次。侵染前轉(zhuǎn)入懸浮MT（附加100口M乙酰丁香酮）培養(yǎng)基屮培養(yǎng)4天后用于侵染。2農(nóng)桿菌侵染液的制備1.農(nóng)桿菌（保存在-70°C）在含有50mg-L卡那霉素的YEB選擇培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28°C暗培養(yǎng)。2.長(zhǎng)出菌落后，挑取單菌落在新的選擇培養(yǎng)基上涂皿。3.取出培養(yǎng)24小時(shí)后的菌落群，再用不加卡那霉素的MT（附加100uM乙酰丁香酮）液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)。4.用分光光度計(jì)測(cè)量菌液的ODgoo值，并用MT液體培養(yǎng)基調(diào)整到OD6

2、oo=0.5?1?0進(jìn)行侵染。3侵染實(shí)驗(yàn)1.將懸浮培養(yǎng)4d的愈傷組織轉(zhuǎn)入稀釋菌液中浸泡20-30mino2.用無(wú)菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)到MT基本培養(yǎng)基上，19°C共培養(yǎng)2?3d。3.共培養(yǎng)后的愈傷組織在無(wú)菌水屮輕輕漂洗數(shù)次，直至洗液變清為止，再加入含有400mg/L頭孑包霉素的無(wú)菌水浸泡20min,傾去洗液。4.將外植體置于無(wú)菌濾紙上吸干，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基（根據(jù)不同的質(zhì)粒載體添加不同濃度的篩選劑），28°C暗培養(yǎng)。4抗性愈傷組織的選擇培養(yǎng)和再生（以質(zhì)粒載體pCAMBIA1303為例）1.愈傷組織剛傳移到篩選培養(yǎng)基上時(shí)，應(yīng)該表現(xiàn)為對(duì)照逐漸褐化、死亡

3、，轉(zhuǎn)化處理的愈傷組織中轉(zhuǎn)化部分逐漸長(zhǎng)出新的抗性愈傷組織。2.將新形成的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至新的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，當(dāng)?shù)玫降目剐耘咝杂鷤M織達(dá)到一定量吋，將一部分轉(zhuǎn)入MT+甘油2%+Cef50mg-L1的胚狀體分化固體培養(yǎng)基上。3.有球形胚狀體開(kāi)始出現(xiàn)后，將得到的胚狀體轉(zhuǎn)入MT+ME1500mg-L1+Cef50mg-L1培養(yǎng)基上，使胚狀體進(jìn)一步長(zhǎng)大，形成子葉型胚狀體。7?9周后，將子葉型胚狀體轉(zhuǎn)入MT+Cef50mg-U1+NAA0.1mg-L'1+BA0.5mg?r+KT0.5mg?r培養(yǎng)基上再生芽，1個(gè)月后就可見(jiàn)再生芽長(zhǎng)出。當(dāng)再生芽長(zhǎng)到2

4、cm左右時(shí)，將其從基部切下轉(zhuǎn)入1/2MT+Cef50mg?「+NAA0.5mg-L'1+IBA0.1mg-L'1+活性炭0.5g?「培養(yǎng)基上生根，也可以通過(guò)試管嫁接的辦法（見(jiàn)相應(yīng)方法說(shuō)明）再生植株。5轉(zhuǎn)化的柑桔材料的PCR鑒定（以g妙基因?yàn)槔┵|(zhì)粒DNA的小量制備采用堿裂解法。采用CTAB法提取植株DNAog力基因的檢測(cè)：根據(jù)gfp*5基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)：5'端引物：（5-TGGCCAACACTTGTCACTAC-3）3'端引物：（5-AGGACCATGTGGTCTCTCTT-3）。PCR反應(yīng)體系為25ul,其中模板0.3-0.5ng,0.2min

5、oldNTP,1.5nunol-L-1Mgcl2,lXTaqDNA聚合酶Buffer,1UTaqDNA聚合酶。循環(huán)反應(yīng)為94°C30s,55°C30s,72°C1min,35個(gè)循環(huán)。（其中的參數(shù)可以根據(jù)基因的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整）6Southern雜交分析：酶切及轉(zhuǎn)膜1.取10也轉(zhuǎn)基因植株DNA,用限制性?xún)?nèi)切酶EcoFlI（T-DNA內(nèi)無(wú)切點(diǎn)）酶切12h左右。1.取1口1電泳檢測(cè)酶切結(jié)果；若酶切完全后，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳，0.8-1.OV/cm電泳18~24h°2.將膠切成膜一樣大小和形狀；用0.2NHCI變性10min,置于轉(zhuǎn)膜臺(tái)上，用0

6、.4NNaOH作為轉(zhuǎn)移緩沖液，將DNA片段轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上，轉(zhuǎn)移約24h。3.轉(zhuǎn)好的膜用2xSSC漂洗兩次，各5mino用濾紙墊夾，80°C真空烘膜2h以上。4.取出冷卻，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆?。分子雜交1.先將尼龍膜用2xSSC漂洗，涼干后裝入雜交爐。2.加入10-20ml(視尼龍膜的數(shù)量而定)預(yù)熱至65°C的預(yù)雜交液置于雜交爐中。3.65°C空氣恒溫?fù)u床預(yù)雜交10小時(shí)以上。4.探針標(biāo)記：采用隨機(jī)引物法。依照不同的尼龍膜數(shù)量而采用不同的反應(yīng)體系。每張膜取100ng探針DNA,加ddHQ至8.0川，100°C變性10min；取出

7、迅速放入冰中冷卻10min；然后加入3.0nldNTP(dATP+dTTP+dGTP),引物及緩沖液5.0(11,KlenowFragment酶(1u/

8、jl)1.0(jI；最后在分子雜交爐內(nèi)加入1.0^1a-32P-dCTP,混勻后置于24°C保溫3h以上。5.雜交：在標(biāo)好的探針中加入600川預(yù)雜交液，敝開(kāi)管蓋，100°C干浴變性10min；置于冰上冷卻5min；一起加入雜交爐，平放65°C空氣恒溫?fù)u床雜交6h以上。6.洗膜：雜交完畢后，將膜從雜交筒屮取出，用1xSSC(加有0.2%SDS)室溫漂洗1次；然后加預(yù)熱至65°C的1xSSC洗膜液

9、置于65°C恒溫?fù)u床洗1~2次；第一次洗15min,第二次洗的時(shí)間依據(jù)膜上信號(hào)強(qiáng)度而定；洗至膜信號(hào)強(qiáng)度為200?300cpm后，取出擺放到濾紙上晾干。