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1、He┐Ne激光照射對(duì)大鼠神經(jīng)損傷后脊髓CGRP表達(dá)的影響 摘要:目的研究10mETHODSInjuredsciaticnerves,madein96SDrats,munohistochemicallystudied.RE┐SULTSExpressionofCGRPincreasedinspinalcordonthefirstdayafterinjuryofsciaticnerve.Moreexpressionof CGRPinsecondandfourthainlyfoundinmotorneuroninanteriorhorna
2、ndsensorynervefiberinposteriorhorn.Ateighthainedahighexpressioninbothgroups,andshootenerveregeneration. 0引言 He-Ne激光有廣泛的生物學(xué)作用,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察均證實(shí)激光照射有促進(jìn)外周神經(jīng)生長(zhǎng)的作用[1],其作用機(jī)制尚待探討.降鈣素基因相關(guān)肽(cal-citoningene-relatedpeptide,CGRP)是由37個(gè)氨基酸殘基組成的神經(jīng)多肽[2,3],起著遞質(zhì)或細(xì)胞外調(diào)節(jié)物樣作用,由降鈣素基因家族編碼,但化學(xué)結(jié)構(gòu)、
3、體內(nèi)分布及生物活性不同于降鈣素,主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)中[4],具有舒血管作用,在神經(jīng)再生過(guò)程中起一定作用[5].我們觀察了He-Ne激光照射損傷大鼠坐骨神經(jīng)后脊髓CGRP表達(dá)的變化. 1材料和方法 1.1動(dòng)物模型及照射方法SD成年雄性大鼠96只,體質(zhì)量(250±20)g,10gL-1戊巴比妥鈉(30mgkg-1,ip)麻醉,常規(guī)消毒,取右側(cè)股后外側(cè)暴露坐骨神經(jīng),于神經(jīng)分叉上0.7cm處眼科剪剪斷,并修剪神經(jīng)斷端的覃狀頭,原位吻合以9個(gè)0的絲線縫合神經(jīng)外膜4~6針,吻合后創(chuàng)口內(nèi)放入慶大霉素2萬(wàn)單位關(guān)閉創(chuàng)口,對(duì)等分激光照射組和對(duì)照組各
4、48只處理.He-Ne激光器(西安產(chǎn))波長(zhǎng)632.8nm,激光照射組照射功率為10m,功率密度為35.39m-2,對(duì)準(zhǔn)神經(jīng)吻合處每次照射10min,照射能量密度為21.23Jcm-2,對(duì)照組做相同處理,激光照射功率輸出為0mL,40gL-1多聚甲醛快速灌注200mL,緩慢滴注300mL,持續(xù)1.5~2h,而后取坐骨神經(jīng)及相應(yīng)脊髓,浸入200gL-1蔗糖液(0.01molL-1PB)4℃過(guò)夜,恒冷箱切片,片厚30μm.用0.01molL-1PBS清洗10min×3→浸入含3gL-1Triton×100的0.01molL-1PBS30m
5、in→0.01molL-1PBS清洗10min×3→加羊抗CGRP(12000,Sigma)4℃孵育48h,取出入0.01molL-1PBS清洗10min×3→加入兔抗羊抗體(1200,Sigma)室溫孵育2h→入0.01molL-1PBS清10min×3→浸入ABC復(fù)合物(1500,Sigma)室溫孵育2h,浸洗硫酸鎳胺加強(qiáng)的DAB藍(lán)色反應(yīng)法顯色、貼片、干燥、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片.應(yīng)用LeicaQ570c真彩色圖像分析儀(德國(guó)),進(jìn)行灰度定量分析,每張切片在損傷側(cè)后角的第3,4板層選5個(gè)高倍視野進(jìn)行陽(yáng)性物質(zhì)密度值測(cè)定,取測(cè)定數(shù)
6、值減去背景測(cè)定數(shù)值的絕對(duì)值,t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析. 圖1-圖2略 2結(jié)果 成年大鼠腰骶段脊髓中CGRP陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)目較少,每一切面多為有1~2個(gè)CGRP陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞,均為前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,染色較淡,無(wú)明顯陽(yáng)性纖維,陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞多為大細(xì)胞,呈圓形或多角形,樹(shù)突較短,陽(yáng)性物質(zhì)主要集中在胞質(zhì),胞核為陰性.坐骨神經(jīng)損傷后1d即發(fā)現(xiàn)損傷側(cè)CGRP陽(yáng)性反應(yīng)增強(qiáng),1的相干光,有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),作用于生物組織可使生物膜分子構(gòu)象發(fā)生改變,改變膜受體結(jié)構(gòu),使細(xì)胞活性發(fā)生變化,有明顯的生物學(xué)刺激作用[6].神經(jīng)修復(fù)是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程,外周神經(jīng)元損傷
7、后可產(chǎn)生一系列的化學(xué)和組織學(xué)變化,一般認(rèn)為,在這種變化中,與神經(jīng)遞質(zhì)代謝有關(guān)的酶蛋白的合成下調(diào),而與軸突存活和修復(fù)有關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白的合成增加,如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)[7]和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP-43)[8]的表達(dá).外周軸突損傷后,可導(dǎo)致CGRP在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中含量增高,而He-Ne激光作為一種外界物理因子,通過(guò)其生物刺激作用使脊髓內(nèi)CGRP表達(dá)增高.激光照射組2araSG,JonasV,RosenfeldMG,OngES,EvansRM.Al-ternativeRNAprocessingincalcitoningeneexpressi
8、ongeneratesmRNAsencodingdifferentpolypeptideproducts[J].Nature,1982;298(5871):240-244.[3]RosenfeldMG,MermondJJ,AmaraS