lamp快速檢測(cè)沙門菌inva基因的方法建立與應(yīng)用

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1、LAMP快速檢測(cè)沙門菌invA基因的方法建立與應(yīng)用【摘要】目的：建立一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)反應(yīng)快速檢測(cè)沙門菌的方法。方法：根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)上的鼠傷寒沙門菌的特異invA和fimA(登錄號(hào)：M90846和M18283)基因序列，設(shè)計(jì)特異引物，提取標(biāo)本DNA，然后以LAMP技術(shù)擴(kuò)增invA基因，PCR方法擴(kuò)增fimA基因，采用瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。結(jié)果：91份血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警瓶，LAMP和PCR法檢測(cè)出陽(yáng)性18份，與最終培養(yǎng)結(jié)果一致；30份糞便標(biāo)本，LAMP和

2、PCR法檢測(cè)出陽(yáng)性5份，培養(yǎng)陽(yáng)性3份，LAMP測(cè)限達(dá)到102CFU／mL。結(jié)論：LAMP是一種簡(jiǎn)便、快速、特異和敏感的檢測(cè)臨床和環(huán)境標(biāo)本中沙門菌的有效方法?！娟P(guān)鍵詞】沙門菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）核酸沙門菌(Salmotlella)是腸桿菌科中一種重要的人獸共患病病原菌，是引起傷寒、腸炎等多種疾病的重要病原菌。目前，對(duì)于沙門菌的檢測(cè)普遍采用培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定等方法，報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果至少需要3～5天，且較為繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、肥達(dá)試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、免疫電泳、PCR等方法均存在對(duì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的特殊要求以及特異性方面的不理想等因素[1,2]。我們應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

3、（LAMP）反應(yīng)快速檢測(cè)沙門菌，報(bào)道如下。81材料與方法1.1試劑和儀器核酸擴(kuò)增儀（MyGetleThermalCycler，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)，BstDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)，PCR試劑盒(Takara公司)，得靈Walkaway96全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，BacT/Alert全自動(dòng)血培養(yǎng)儀及其配套的血培養(yǎng)瓶(法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品)。1.2標(biāo)本和菌株來(lái)源91份陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶和30份糞便標(biāo)本均來(lái)自溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院細(xì)菌室。鑒定特異性的參照菌株除標(biāo)準(zhǔn)ATCC菌株購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，其它菌株均為溫州醫(yī)學(xué)院細(xì)菌室臨床鑒定菌株。1.3引物針

4、對(duì)鼠傷寒沙門菌的invA和fimA基因(GenBank登錄號(hào)：M90846和M18283)分別設(shè)計(jì)特異LAMP和PCR特異引物(上海生工合成)。1.4陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中細(xì)菌DNA模板提取采取鹽酸胍苯甲醇法[3]：①?gòu)年?yáng)性血培養(yǎng)瓶中以無(wú)菌方式取100μl培養(yǎng)物置入1．5ml的EP管中，然后加入5M鹽酸胍緩沖液100μl，渦旋振蕩5min；②依次加入400μl雙蒸水和800μl苯甲醇，渦旋振蕩1min，然后在4℃8下以700×g離心5min；③取上層水相約0.4ml到一新Ep管，依次加入3M醋酸鈉緩沖液40μl和異丙醇0．44ml，然后在4℃T16，000×g離心15min；

5、④倒掉上層液體，加入1ml70％乙醇洗滌，然后在4℃T16，000×g離心10min，接著倒掉上層的乙醇，待自然干燥后加入100μl雙蒸水溶解管底的DNA沉淀備用。1.5糞便標(biāo)本細(xì)菌DNA直接提取按照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。1.6綿羊血瓊脂平板上菌株的DNA提取挑取1個(gè)以上純菌落置入內(nèi)含100μl裂解液(蛋白酶K濃度為200ng／ml的0．5％NP40溶液)的0．5ml離心管內(nèi)，56℃水浴1小時(shí)，95℃水浴消化15min，然后14，000r／min，離心30秒，上清液即為PCR擴(kuò)增檢測(cè)的模板液。1.7標(biāo)本檢測(cè)對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶和糞便培養(yǎng)標(biāo)本提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行LAMP和PCR檢測(cè)

6、，并同時(shí)對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行傳統(tǒng)方法鑒定，根據(jù)沙門菌分型抗血清和生化鑒定結(jié)果確診沙門菌。LAMP反應(yīng)體系(25μl)中包括1.6μmol／L的引物FIP和BIP,0.2μmol／L的引物F3和B3，1.2mmol／L的dNTP，4mmol／LMgSO4，1×thermopolbuffer(NewEnglandBiolabs)，0.8mol／Lbetaine和2.5μl的模板，反應(yīng)條件為：先95℃5min，然后冰上冷卻，再加入8UBstDNA聚合酶1μl，63℃恒溫1小時(shí)，最后80℃，3min終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(25μl)條件為：0.2mmol／L的dNTP、1．25U的

7、Taq酶0．4μ8mol／L的正反向引物、1．5mmol／L的Mg2+和3．0μl的模板。反應(yīng)條件為：先94℃2min，再按94℃1min→52℃30s→72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。兩種方法產(chǎn)物分別在含溴化乙啶的2％瓊脂糖中電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照像。1.8特異性和最低檢測(cè)限分析將由參照菌株提取的DNA進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)特異性；將臨床鑒定鼠傷寒沙門菌接種于綿羊血瓊脂平板過(guò)夜培養(yǎng)，然后挑取菌落制備一系列濃度的菌懸液提取模板DNA，最后以LAMP和PCR擴(kuò)增各濃度模板中的相應(yīng)特異基因。2結(jié)果2.