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《rna干擾survivin基因表達(dá)對肝癌細(xì)胞放射敏感性影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、第1章材料與方法1．1材料1．1．1主要試劑與儀器標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司RPMI1640培養(yǎng)基美國Gibco公司磷酸鹽緩沖液北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司胃蛋白酶(1：30)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司胰蛋白酶(1：100)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒Invitrogen公司OPTI—MEMI優(yōu)化培養(yǎng)基Invitrogen公司四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)Sigma公司Trizol試劑Invitrogen公司細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒碧云天RT—PCR試劑盒大連寶生生物工程有限公司小分子量蛋白MarkerGalen公司二氧化碳培養(yǎng)箱美國T
2、hermoElectronCorporation公司液氮罐美國ThermoElectronCorporation公司電子分析天平(臥式，BP3100S)SartoriusBasicplus，Germany高速離心機(jī)上海醫(yī)用儀器生產(chǎn)廠恒溫磁力攪拌器Heidolph，Germany細(xì)胞培養(yǎng)瓶美國Corning公司倒置顯微鏡0LYMPUS公司恒溫水浴箱北京醫(yī)療設(shè)備廠臺式微稱量天平上海天平儀器廠BTY-S．D．1000KT型超凈工作臺國家海洋局第一海洋研究所高壓消毒柜MicromseriesSA一300凝膠成像系統(tǒng)KodakEDAS290酶標(biāo)檢測儀BIO-RAD流式細(xì)胞儀(B．D．Vantage型)
3、Becton—DiksonFACSVantageUSAPCR擴(kuò)增儀美國RE公司2ul，10
4、l1，200ul，1000u121：I樣槍LabsystemsFinland1青島大學(xué)碩士學(xué)位論文1．1．2細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株HepG2由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室提供，在RPMI1640培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為0．10胎牛血清)中培養(yǎng)，置于37。C體積分?jǐn)?shù)為0．05的C0：溫箱中，每2-3天傳代一次，選用處于對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞開始實驗。1．2方法1．2。1重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)RNA設(shè)計原則及survivin基因(NM一001168)編碼序列，利用BLAST進(jìn)行查詢，并以前期實驗結(jié)果為依據(jù)畸1，特異
5、性的合成1對針對survivin編碼序列的siRNA片段，并構(gòu)建survivin基因的重組載體pshRNA—survivin一387，基因靶點位于survivin基因序列第387位點，靶基因序列為5’一GAAAGTGCGCCGTGCCATC一3’。重組載體兩端設(shè)有BarnHI或Bbs工酶切位點，以利于與pGPHl／GFP／Neo載體連接。按照實驗設(shè)計，由上海吉瑪公司構(gòu)建合成陰性對照表達(dá)載體pshRNA—survivin—NC及陽性對照表達(dá)載體pshRNA-survivin-GAPDH。三種重組質(zhì)粒包含綠色熒光蛋白的表達(dá)框架，轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可表達(dá)綠色熒光蛋白，用熒光顯微鏡可確定轉(zhuǎn)染效率。圖1pGP
6、HI／GFP／Neo載體緒構(gòu)1．2．2細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染4第1章材料與方法轉(zhuǎn)染前24h，取處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，傳代接種于6孔板，2ml無抗完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞數(shù)約5×105個／每孔，培養(yǎng)于37。C、含體積分?jǐn)?shù)0．05C02培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度達(dá)到70"--'90％。分別設(shè)置空白對照組(不加液體)、陰性對照組(每孔加pshRNA—survivin—NC4ug)、siRNA轉(zhuǎn)染組(每孑LJJnpshRNA-survivin一3874ug)。每組各設(shè)5個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染過程按Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行。質(zhì)粒(ug)與脂質(zhì)體(u1)的比例為l：2．5。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞板
7、置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育4—6h后除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24-48h后于熒光顯微鏡下計算轉(zhuǎn)染效率。1．2．3RT-PCR技術(shù)檢測surviVinmRNA水平轉(zhuǎn)染48h后分別收集3組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為107／L，采用TrizoL法提取總RNA。RT反應(yīng)體系為20uL(包括提取的RNA2uL，PrimescriptRTaseluL、OligodTlul、dNTPlul和適量5*RTbuffer、氯化鎂)，混勻，于PCR儀上行RT反應(yīng)，反應(yīng)條件：42℃60min，95℃5min，終止反應(yīng)合成eDNA。PCR擴(kuò)增體系為50uL，反應(yīng)條件：94。C變性30s，55。C退火45s，72"(2延伸1
8、min，共35個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物，在含EB的20g／L的瓊脂糖凝膠中電泳分離后，以凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，上游引物序列：5’一TCAAGGACCAcCG—CATCTCTA一3’，下游引物序列：5’一CCAGCTCCTT—GAAGCAGAAGAA一3’。以GAPDH作為內(nèi)參照。應(yīng)用分析軟件進(jìn)行相對定量分析，survivinmRNA水平以survivin產(chǎn)物量
