水貂綠膿桿菌(pasd03株)鞭毛蛋白的免疫保護(hù)性研究

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1、萬方數(shù)據(jù)ImmunoprotectiveefficacyofFlagellinfromMinkPseudomonasAeruginosa(PASD03strain)Thesissubmittedto@ngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyWuJuan(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：Prof．ShanHu，Prof．

2、QinXiaobingQingdao．ChinaJune，2013萬方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得青島農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：時(shí)間：功廖年廠月沖日I關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解青島農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文

3、的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意青島農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：時(shí)間：％侈年廠月巧13導(dǎo)師簽名：岙吃舛v時(shí)間：≯∥年鄉(xiāng)月呷日‘萬方數(shù)據(jù)壹璺壅些太堂亟±堂位監(jiān)塞擅墨水貂綠膿桿菌(PASD03株)鞭毛蛋白的免疫保護(hù)性研究摘要綠膿桿菌(銅綠假單胞茵)(Pseudomonasaemginosa，PA)可引起人及多種動(dòng)物發(fā)病，是一種嚴(yán)重危害人類健康及畜牧業(yè)發(fā)展的重要致病茵。近年來，

4、隨著毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，疾病竹發(fā)生也逐年增多，尤其是細(xì)菌病的危害加大，由水貂綠膿桿菌導(dǎo)致的水貂出血性肺炎常表現(xiàn)為群體的急性暴發(fā)，水貂前期咳嗽，后期體溫升高，呼吸困難，口鼻流血，死亡率逐年增高。綠膿桿菌對(duì)外界的抵抗力極強(qiáng)，由于II缶床治療中抗菌藥物的廣泛使用，以及不合理應(yīng)用，導(dǎo)致綠膿桿菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥譜不斷擴(kuò)大，同時(shí)也加劇了抗菌藥物在水貂體內(nèi)的殘留，嚴(yán)重威脅我國(guó)皮毛業(yè)的發(fā)展，給人類造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。此外綠膿桿菌血清型眾多，不同血清型菌株其免疫原性不盡相同，給綠膿桿菌疫苗的研制帶來很大困難。我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中的綠膿桿菌耐

5、藥情況已是十分嚴(yán)重，且呈現(xiàn)多重耐藥特性。因此獲得一種理想的疫苗來預(yù)防水貂綠膿桿菌病顯得尤為重要。有實(shí)驗(yàn)證明鞭毛蛋白是重要的表面抗原，具有種屬特異性，且不同血清型之間具有相同的鞭毛蛋白免疫原，能產(chǎn)生交叉保護(hù)作用。鑒于綠膿桿菌感染的普遍性，以及鞭毛蛋白的特點(diǎn)，本研究通過提取的鞭毛蛋白，并結(jié)合小白鼠免疫模型分析其免疫原性，探討綠膿桿菌鞭毛蛋白疫苗對(duì)于綠膿桿菌感染的保護(hù)作用，對(duì)構(gòu)建綠膿桿菌抗病疫苗和從根本上防止綠膿桿菌的感染具有重要意義。本試驗(yàn)首先，探索了培養(yǎng)條件對(duì)PASD03的鞭毛生長(zhǎng)的影響。分別從培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)溫度進(jìn)

6、行培養(yǎng)比較。通過一系列試驗(yàn)及鞭毛鍍銀染色，最后確定了提取綠膿桿菌鞭毛的最佳條件：液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)更適合于綠膿桿菌快速生長(zhǎng)，適合鞭毛發(fā)育，能在短時(shí)間培養(yǎng)內(nèi)進(jìn)行鞭毛染色；培養(yǎng)時(shí)間從22小時(shí)至48小時(shí)都能染出鞭毛，而這個(gè)時(shí)間和細(xì)菌生長(zhǎng)階段的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相吻合，為了進(jìn)一步確定細(xì)菌出現(xiàn)鞭毛的最佳時(shí)機(jī)，又進(jìn)行了OD值與鞭毛生長(zhǎng)規(guī)律的研究，鞭毛染色鏡檢，繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示PASD03進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，幾乎每個(gè)時(shí)間段都能染出鞭毛，為了保證鞭毛的提取量，必須確保細(xì)菌的數(shù)量足夠大，因此在PASD03剛進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)不易馬上進(jìn)行鞭毛的提取試驗(yàn)，而

7、應(yīng)再讓細(xì)茵生長(zhǎng)一段時(shí)間。即培養(yǎng)時(shí)間確定為使細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后的一段萬方數(shù)據(jù)時(shí)間；綠膿桿茵在4-42℃范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，而鞭毛生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)溫度為37℃左右。其次對(duì)PASD03鞭毛蛋白的提取方法進(jìn)行研究，分別通過酸裂解、差速離心以及酸裂解結(jié)合機(jī)械振蕩三種方法，用(NH4)2S04鹽析來獲得鞭毛蛋白，采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS．PAGE)對(duì)提取的綠膿桿菌鞭毛蛋白進(jìn)行分離純化，Western免疫印跡檢測(cè)，并進(jìn)行電鏡鑒定。結(jié)果顯示，成功分離出水貂綠膿桿菌的鞭毛蛋白，獲得了綠膿桿菌鞭毛蛋白的初提液。提純的綠膿桿菌鞭毛蛋白經(jīng)

8、SDS—PAGE顯示為一條蛋白帶，相對(duì)分子質(zhì)量m)為53K．Da；Western免疫印跡檢測(cè)亦提示條帶在Mr53KDa處，透射電鏡(SEM)觀察表明該鞭毛蛋白呈絲狀；三者均證實(shí)該蛋白為同一均質(zhì)蛋白。并且得出：經(jīng)酸裂解法并結(jié)合機(jī)械振蕩和硫酸銨沉淀法簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、純度高、產(chǎn)量高，適用于綠膿桿茵