土壤稀釋涂布平板法

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1、實(shí)驗(yàn)概要分離、純化及初步鑒定土壤中的拮抗植物病原菌的放線菌。實(shí)驗(yàn)原理土壤是微生物的“天然培養(yǎng)基”，也是最豐富的菌種資源庫，我們可以從中分離出眾多放線菌，尤其是可以從耕作土壤中篩選出拮抗植物病原菌的放線菌。以耕作有武運(yùn)粳和蘇滬香粳的土壤為樣品，應(yīng)用稀釋涂布平板法分離各種微生物。菌落計(jì)數(shù)后，通過菌落形態(tài)觀察并挑取放線菌進(jìn)行劃線分離純化，多次重復(fù)后得到單菌落。在進(jìn)行放線菌形態(tài)等初步鑒定后，將純化的菌株接入斜面?zhèn)鞔２亍Ｗ詈?，分離純化的放線菌，初步鑒定其拮抗性。拮抗植物病原菌的放線菌的分離純化在農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、作物種植等方面都有著重要

2、的意義。?主要試劑1.培養(yǎng)基：高氏1號培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基2.其他試劑：?銀染液A液B液（細(xì)菌鞭毛染色）?40%KOH?5%α-萘酚（V.P.實(shí)驗(yàn)）?主要設(shè)備培養(yǎng)皿試管錐型瓶接種環(huán)移液管震蕩器電爐載玻片超凈工作臺恒溫培養(yǎng)箱高壓蒸汽滅菌鍋顯微鏡等實(shí)驗(yàn)材料土樣：蘇滬香粳1，2組楊稻6號93113，4組武運(yùn)粳5，6組實(shí)驗(yàn)步驟1.稀釋涂布平板法(SpreadPlateMethod)稀釋涂布平板法是一種將菌體按比例制備成若干個稀釋度，再分別經(jīng)涂棒涂布培養(yǎng)而進(jìn)行微生物分離純化的方法。?

3、?(1)倒平板；?????(2)制備土壤稀釋溶液連續(xù)不斷稀釋，得到不同稀釋度的土壤溶液；??(3)涂布分別吸取三種稀釋度菌液，均勻涂于培養(yǎng)基表面；??(4)培養(yǎng)；???(5)劃線分離，直到獲得純培養(yǎng)。?2.?平板菌落計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說一個菌落即代表一個單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時，先將待測樣品作一系列稀釋，再取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿中，使其均勻分布于平皿中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可換算出樣品中的含菌數(shù)

4、。這種計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是能測出樣品中的活菌數(shù)。此法常用于某些成品檢定（如殺蟲菌劑），生物制品檢定以及食品、水源的污染程度的檢定等。但平板菌落計(jì)數(shù)法的手續(xù)較繁，而且測定值常受各種因素的影響。對每個平板上的菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算每克或每毫升土壤樣品中含有細(xì)菌、放線菌的數(shù)量。公式如下：菌體數(shù)量cfu/g（mL）土樣==同一稀釋度重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)3.?平板劃線分離法（StreakPlateMethod）平板劃線分離培養(yǎng)法對混有多種菌的平皿，用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料,在無板表面進(jìn)行平行劃線和培養(yǎng)，使原來混雜在一起的菌種

5、沿劃線在瓊脂平板表面分離，得到分散的單個菌落，以獲得純種。??(1)倒平板；???(2)劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線，從而將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，形成單個菌落；??(3)挑菌落同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認(rèn)為純化為止。??4.?插片顯微觀察法（放線菌）插片培養(yǎng)法是實(shí)驗(yàn)室觀察放線菌形態(tài)的一種基本方法，其步驟是：挑取青銅小單孢菌（Micromonosporachalcea）的少量孢子絲，將菌絲塊接種于高氏一號培養(yǎng)基的中間，然后，用小鑷子夾起一塊無菌的蓋玻片，以45度角的

6、角度斜插入培養(yǎng)基中，不要插入培養(yǎng)基太深，讓菌絲爬上蓋玻片；于37℃下培養(yǎng)3～5天后，再用小鑷子將蓋玻片取出，顯微鏡下觀察基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲的形狀。5.?斜面?zhèn)鞔２胤ㄐ泵鎮(zhèn)鞔２胤ㄊ侵笇⒕N（細(xì)菌和酵母菌宜采用對數(shù)生長期細(xì)胞，放線菌和絲狀真菌宜采用成熟的孢子）接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2-4個月，移種1次。酵母菌2個月，移種1次。細(xì)菌最好每月移種1次。此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏

7、法，優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機(jī)會亦較多。6.?放線菌形態(tài)觀察??(1)放線菌菌落觀察放線菌的菌落質(zhì)地致密，表面呈緊密的絨狀，或堅(jiān)實(shí)、干燥而多皺。由于基內(nèi)菌絲長在培養(yǎng)基內(nèi)，所以菌落與培養(yǎng)基結(jié)合較緊，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。當(dāng)孢子絲形成大量孢子布滿菌落表面時，使菌落呈絮狀、粉末狀或顆粒狀，而與細(xì)菌菌落判然有別。此外，如用放大鏡仔細(xì)

8、觀察，可以看見菌落周圍有放射狀菌絲。?　(2)放線菌主要通過形成無性孢子的方式進(jìn)行繁殖。其孢子絲成熟時，分化形成許多孢子，稱為分生孢子。分生孢子常具色素，呈白、灰、黃、橙黃、紅、藍(lán)、綠等顏色。