基因工程的酶學基礎(I)

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1、2基因工程的酶學基礎第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié)DNA連接酶第三節(jié)DNA聚合酶第四節(jié)DNA修飾酶第五節(jié)核酸外切酶第六節(jié)單鏈核酸內(nèi)切酶1一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。（Restrictionendonuclease）22.性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保護作用3.功能細菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1.來源34細菌自身DNA的堿基被

2、甲基化酶甲基化(修飾)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割而保護。（2）修飾（Modification）①Dam甲基化酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源DNA進行分解，切成小片斷。（1）限制（Restriction5（3）限制與修飾系統(tǒng)相關的三個基因①hsdR:編碼限制性內(nèi)切酶②hsdM:編碼限制性甲基化酶③hsd

3、S:編碼限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的協(xié)同表達這類酶能識別DNA分子上的特定位點，并將雙鏈DNA切斷這類酶使DNA分子特定位點上的堿基甲基化，即起修飾DNA的作用。作用是協(xié)同上述兩種酶識別特殊的作用位點。61973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：二、限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個字母大寫種名的前兩個字母小寫由3個字母形成的略語表示寄主菌的物種名，組成酶的基本名稱。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluen

4、zae）用Hin表示74.如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則用一個大寫字母表示此染色體外遺傳成分。如Hind：d菌株EcoR：抗藥性R質(zhì)粒85.如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復系統(tǒng)，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶的先后次序。如HindⅡ：d菌株中發(fā)現(xiàn)的第二個酶6.所有的限制酶，除以上名稱外還要冠以系統(tǒng)名稱。限制性內(nèi)切酶的系統(tǒng)命名為R，甲基化酶為M。如R.HindⅢ表示限制性內(nèi)切酶M.HindⅢ表示相應的甲基

5、化酶實際應用中，R常被省略。9屬名種名株名HindIIIHindIIIHaemophilusinfluenzaed嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名10目前已發(fā)現(xiàn)600多種限制性內(nèi)切酶，分為三類。三、限制性內(nèi)切酶的類型限制性核酸內(nèi)切酶的分類分類依據(jù)1）依據(jù)識別序列與切割位點是否一致2）所需輔助因子分為三類：I型酶、II型酶、III型酶11首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌B株和K株分離的。（1）識別序列Eco

6、B：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.Ⅰ型限制性內(nèi)切酶的基本特性如EcoBEcoK未甲基化修飾的特異序列12需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）（3）輔助因子在距離特異性識別序列上游約1000—1500bp處隨機切開一條單鏈，兩條鏈上的切點相距70~75bp，即末端為單鏈。Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位點13I型酶：限制修飾系統(tǒng)酶異源多聚體，R、M、S分別為限制性內(nèi)切酶、甲基化酶、特異位點識別的活性。識別序列全甲基化-不識別識別序列半甲

7、基化-甲基化作用識別序列未甲基化-限制性內(nèi)切酶作用識別序列與切割位點不一致，且切割位點隨機不定ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）142.Ⅲ型限制性內(nèi)切酶識別序列與切割位點不相一致切割位點相對固定反應需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG15識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側識別切割（一致）序列呈典型的旋轉對稱型回文結構2.Ⅱ類限制性內(nèi)切酶的基本特性5‘…GCT

8、GAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點16EcoRI等產(chǎn)生的5’-粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃退火4-7℃5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-